تحديد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) هو الأسلوب القياسي الذهبي لقياس البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرة السلية التي قد تستغرق أسابيع لتشكيل مستعمرات مرئية. هنا نصف وحدة CFU الصغيرة لتحديد CFU مع زيادة كفاءة الوقت ، وتقليل مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، وقابلية التوسع في تجارب الإنتاجية المتوسطة والعالية.
قتل السل (TB) ، وهو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم بسبب عامل معدي ، 1.6 مليون شخص في عام 2022 ، ولم يتجاوزه سوى COVID-19 خلال جائحة 2019-2021. هذا المرض ناجم عن بكتيريا المتفطرة السلية (M.tb). سلالة المتفطرة البوفية Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ، لقاح السل الوحيد ، هي أقدم لقاح مرخص في العالم ، ولا يزال قيد الاستخدام. حاليا ، هناك 12 لقاحا في التجارب السريرية وعشرات اللقاحات قيد التطوير قبل السريري. الطريقة المفضلة المستخدمة لتقييم فعالية لقاحات السل في الدراسات قبل السريرية هي تعداد المستعمرات البكتيرية بواسطة فحص وحدات تكوين المستعمرات (CFU). يستغرق هذا الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا من 4 إلى 6 أسابيع حتى ينتهي ، ويتطلب مساحة كبيرة للمختبر والحاضنة ، وله تكاليف كاشف عالية ، وعرضة للتلوث. نصف هنا طريقة محسنة لتعداد المستعمرات ، وهي micro-CFU (mCFU) ، والتي تقدم حلا بسيطا وسريعا لتحليل نتائج فعالية لقاح السل . يتطلب اختبار mCFU كواشف أقل بعشرة أضعاف ، ويقلل من فترة الحضانة ثلاثة أضعاف ، ويستغرق من 1 إلى 2 أسابيع للانتهاء ، ويقلل من مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، ويقلل من مخاطر الصحة والسلامة المرتبطة بالعمل مع أعداد كبيرة من M.tb. علاوة على ذلك ، لتقييم فعالية لقاح السل ، يمكن الحصول على عينات من مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك الأنسجة من الملقحة المصابة بالمتفطرات. كما وصفنا طريقة محسنة لإنتاج ثقافة متفطرات أحادية الخلية وموحدة وعالية الجودة لدراسات العدوى. وأخيرا، نقترح اعتماد هذه الأساليب عالميا في الدراسات قبل السريرية لتحديد فعالية اللقاح، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تقليل الوقت في تطوير لقاحات ضد السل.
السل (TB) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم من قبل عامل معدي واحد ، بكتيريا المتفطرة السلية (M.tb) ، مما يؤدي إلى مقتل عدد أكبر من الناس أكثر من أي ممرض آخر. في عام 2021 ، كان السل مسؤولا عن 1.6 مليون حالة وفاة وتجاوزه COVID-19 خلال جائحة 2019-20211. علاوة على ذلك ، وفقا لتقرير السل العالمي الصادر عن منظمة الصحة العالمية لعام 2022 ، كانت جائحة COVID-19 مسؤولة عن زيادة حالات السل الجديدة. كما أبلغت منظمة الصحة العالمية عن انخفاض كبير في عدد الأشخاص الذين تم تشخيص إصابتهم بالسل خلال هذه الفترة ، مما قد يزيد من عدد حالات السل1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) هي سلالة حية موهنة من المتفطرة البوفية المسببة للأمراض ، والتي استخدمت لأول مرة كلقاح منذ أكثر من 100 عام. هذا هو اللقاح الوحيد ضد السل وهو أقدم لقاح مرخص في العالم لا يزال قيد الاستخدام 2,3. حاليا ، هناك 12 لقاحا في مراحل مختلفة من التجارب السريرية4 ، وعشرات اللقاحات قيد التطوير قبل السريري 5,6. يشمل التقييم قبل السريري للقاحات ضد السل تقييم السلامة والمناعة7 ، والتي يمكن الحصول عليها في نماذج حيوانية متنوعة مثل الزرد والفئران وخنازير غينيا والأرانب والماشية والرئيسيات غير البشرية8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تقييم قدرة اللقاح على تحفيز الحماية من عدوى السل المتعدد الأطراف و / أو انتقاله ، أي فعالية اللقاح ، تحدي السل متعدد السل في الجسم الحي 5,11. ومن المثير للاهتمام ، أن تطعيم BCG يحفز تأثيرات غير محددة تؤثر على بقاء مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية الأخرى12,13 من خلال آلية المناعة المدربة14. لتحديد العبء البكتيري القابل للحياة في مصاب ، فإن الطريقة المفضلة هي تعداد المستعمرات البكتيرية من خلال فحص وحدات تكوين المستعمرات (CFU) 5,15. CFU هي وحدة تقدر عدد الكائنات الحية الدقيقة (البكتيريا أو الفطريات) التي تشكل مستعمرات في ظل ظروف نمو محددة. تنشأ وحدات CFU من الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة والقابلة للتكرار ، ويصعب تقدير العدد المطلق للكائنات الحية الدقيقة داخل كل مستعمرة. من غير المؤكد ما إذا كانت المستعمرة قد نشأت من واحد أو أكثر من الكائنات الحية الدقيقة. تعكس وحدة CFU عدم اليقين هذا ، وبالتالي يمكن ملاحظة تباين كبير في النسخ المتماثلة لنفس العينة. يتطلب هذا الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا فنيين متخصصين مدربين للعمل في مرفق من مستوى السلامة الأحيائية 3 (BSL3) ، ومساحة كبيرة للمختبر والحاضنة ، ويستغرق من 4 إلى 6 أسابيع للانتهاء ، وهو عرضة للتلوث.
في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة محسنة لتعداد المستعمرات ، micro-CFU (mCFU) ، ونقدم حلا بسيطا وسريعا لتحليل النتائج15،16،17،18،19،20. يتطلب اختبار mCFU كواشف أقل بعشرة أضعاف ، ويقلل من فترة الحضانة ثلاثة أضعاف ، ويستغرق من 1 إلى 2 أسابيع للانتهاء ، ويقلل من مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، ويقلل من مخاطر الصحة والسلامة المرتبطة بالعمل مع أعداد كبيرة من M.tb. نقترح اعتماد هذه الطريقة عالميا للدراسات قبل السريرية لتحديد فعالية اللقاح ، مما يؤدي في النهاية إلى تقليل الوقت في تطوير لقاحات ضد السل. أخيرا ، تم استخدام هذه الطريقة المثلى لتعداد CFU لتحديد ليس فقط المتفطرات ولكن أيضا البكتيريا الأخرى ، مثل الإشريكية القولونية ورالستونيا سولاناسيروم21.
السل مشكلة صحية عمومية هامة تزداد أهميتها، ولا سيما في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل. تسبب تعطل أماكن الرعاية الصحية لتشخيص السل وعلاجه أثناء جائحة كوفيد-19 في تأثير سلبي على حدوث الحالات الجديدة1. وبالإضافة إلى ذلك، يجب التصدي على وجه الاستعجال لسلالات السل المتعددة …
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل بتمويل داخلي من كلية الطب ، الجامعة الكاثوليكية البرتغالية ، وتمويل خارجي من Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) ، في إطار المنح UIDP / 04279/2020 و UIDB / 04279/2020 و EXPL / SAU-INF / 0742/2021.
96-well plates | VWR | 734-2781 | |
DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
DSLR camera | Nikon | D3400 | |
DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
OADC enrichment | BD | 211886 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |