क्षय रोग के खिलाफ टीकों की प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए माइक्रो-कॉलोनी बनाने वाली इकाई परख
Summary
कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) का निर्धारण बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए स्वर्ण-मानक तकनीक है, जिसमें माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस भी शामिल है, जिसे दृश्यमान कॉलोनियों को बनाने में सप्ताह लग सकते हैं। यहां हम सीएफयू निर्धारण के लिए एक माइक्रो-सीएफयू का वर्णन करते हैं जिसमें बढ़ी हुई समय दक्षता, कम प्रयोगशाला स्थान और अभिकर्मक लागत, और मध्यम और उच्च थ्रूपुट प्रयोगों के लिए स्केलेबिलिटी है।
Abstract
तपेदिक (टीबी), एक संक्रामक एजेंट द्वारा दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण, 2022 में 1.6 मिलियन लोगों की जान ले गया, केवल 2019-2021 महामारी के दौरान COVID-19 से आगे निकल गया। यह रोग जीवाणु माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (M.tb) के कारण होता है। माइकोबैक्टीरियम बोविस स्ट्रेन बेसिलस कैलमेट-गुएरिन (बीसीजी), एकमात्र टीबी वैक्सीन, दुनिया का सबसे पुराना लाइसेंस प्राप्त टीका है, जो अभी भी उपयोग में है। वर्तमान में, नैदानिक परीक्षणों में 12 टीके हैं और पूर्व-नैदानिक विकास के तहत दर्जनों टीके हैं। पूर्व-नैदानिक अध्ययनों में टीबी के टीकों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पसंद की विधि कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) परख द्वारा बैक्टीरिया कालोनियों की गणना है। इस समय लेने वाली परख को समाप्त होने में 4 से 6 सप्ताह लगते हैं, इसके लिए पर्याप्त प्रयोगशाला और इनक्यूबेटर स्थान की आवश्यकता होती है, इसमें उच्च अभिकर्मक लागत होती है, और संदूषण का खतरा होता है। यहां हम कॉलोनी गणना के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं, माइक्रो-सीएफयू (एमसीएफयू), जो एमटीबी वैक्सीन प्रभावकारिता परिणामों का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और तेज़ समाधान प्रदान करता है। एमसीएफयू परख के लिए दस गुना कम अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, इनक्यूबेशन अवधि को तीन गुना कम कर देता है, समाप्त होने में 1 से 2 सप्ताह लगते हैं, प्रयोगशाला स्थान और अभिकर्मक लागत को कम करता है, और बड़ी संख्या में एमटीबी के साथ काम करने से जुड़े स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिमों को कम करता है। इसके अलावा, टीबी वैक्सीन की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न स्रोतों से नमूने प्राप्त किए जा सकते हैं, जिसमें माइकोबैक्टीरिया से संक्रमित टीकाकरण वाले जानवरों के ऊतक शामिल हैं। हम संक्रमण अध्ययन के लिए एक एककोशिकीय, समान और उच्च गुणवत्ता वाले माइकोबैक्टीरियल संस्कृति का उत्पादन करने के लिए एक अनुकूलित विधि का भी वर्णन करते हैं। अंत में, हम प्रस्ताव करते हैं कि इन तरीकों को टीके की प्रभावकारिता निर्धारण के पूर्व-नैदानिक अध्ययनों के लिए सार्वभौमिक रूप से अपनाया जाना चाहिए, जिससे अंततः टीबी के खिलाफ टीकों के विकास में समय कम हो सके।
Introduction
क्षय रोग (टीबी) दुनिया भर में एक संक्रामक एजेंट, जीवाणु माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (एमटीबी) द्वारा मौत का प्रमुख कारण है, जो किसी भी अन्य रोगज़नक़ की तुलना में अधिक लोगों को मारता है। 2021 में, टीबी 1.6 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदार था और 2019-2021 महामारी1 के दौरान COVID-19 से आगे निकल गया था। इसके अलावा, विश्व स्वास्थ्य संगठन की 2022 की वैश्विक TB रिपोर्ट के अनुसार, COVID-19 महामारी टीबी के नए मामलों में वृद्धि के लिए जिम्मेदार थी। डब्ल्यूएचओ इस अवधि के दौरान टीबी से पीड़ित लोगों की संख्या में बड़ी गिरावट की भी रिपोर्ट करता है, जिससे टीबीके मामलों की संख्या और बढ़ सकती है।
बैसिलस कैलमेट-गुएरिन (बीसीजी) रोगजनक माइकोबैक्टीरियम बोविस का एक लाइव-एटेन्यूएटेड स्ट्रेन है, जिसका उपयोग पहली बार 100 साल पहले वैक्सीन के रूप में किया गया था। यह टीबी के खिलाफ एकमात्र टीका है और दुनिया का सबसे पुराना लाइसेंस प्राप्त टीका है जो अभी भी उपयोग में है। वर्तमान में, नैदानिक परीक्षणों के विभिन्न चरणों में 12 टीकेहैं 4, और दर्जनों टीके पूर्व-नैदानिक विकास 5,6 के अधीन हैं। टीबी के खिलाफ टीकों के पूर्व-नैदानिक मूल्यांकन में सुरक्षा और इम्युनोजेनेसिटी7 का मूल्यांकन शामिल है, जिसे जेब्राफिश, चूहों, गिनी सूअरों, खरगोशों, मवेशियों और गैर-मानव प्राइमेट 8,9,10 जैसे विभिन्न पशु मॉडल में प्राप्त किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एमटीबी संक्रमण और/या संचरण, यानी वैक्सीन प्रभावकारिता के खिलाफ सुरक्षा को प्रेरित करने के लिए वैक्सीन की क्षमता का आकलन करने के लिए विवो 5,11 में एमटीबी चुनौती की आवश्यकता होती है। दिलचस्प है, बीसीजी टीकाकरण गैर-विशिष्ट प्रभाव पैदा करता है जो प्रशिक्षित प्रतिरक्षा14 के तंत्र के माध्यम से अन्य जीवाणु और वायरल रोगजनकों12,13 के अस्तित्व को प्रभावित करता है। एक संक्रमित जानवर में व्यवहार्य जीवाणु बोझ यों करने के लिए, पसंद की विधि कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएफयू) परख 5,15 के माध्यम से जीवाणु कालोनियों की गणना है. सीएफयू एक इकाई है जो सूक्ष्मजीवों (बैक्टीरिया या कवक) की संख्या का अनुमान लगाती है जो विशिष्ट विकास स्थितियों के तहत उपनिवेश बनाते हैं। सीएफयू व्यवहार्य और प्रतिकृति सूक्ष्मजीवों से उत्पन्न होते हैं, और प्रत्येक कॉलोनी के भीतर जीवित सूक्ष्मजीवों की पूर्ण संख्या का अनुमान लगाना मुश्किल है। यह अनिश्चित है कि एक कॉलोनी की उत्पत्ति एक या अधिक सूक्ष्मजीवों से हुई है या नहीं। सीएफयू इकाई इस अनिश्चितता को दर्शाती है, इसलिए एक ही नमूने की प्रतिकृतियों में एक महान परिवर्तनशीलता देखी जा सकती है। इस समय लेने वाली परख के लिए जैव सुरक्षा स्तर 3 (बीएसएल 3) सुविधा, पर्याप्त प्रयोगशाला और इनक्यूबेटर स्थान में काम करने के लिए प्रशिक्षित विशेष तकनीशियनों की आवश्यकता होती है, निष्कर्ष निकालने में 4 से 6 सप्ताह लगते हैं, और संदूषण का खतरा होता है।
इस अध्ययन में, हम कॉलोनी गणना, माइक्रो-सीएफयू (एमसीएफयू) के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं, औरपरिणामों 15,16,17,18,19,20 का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और तेज़ समाधान प्रदान करते हैं। एमसीएफयू परख के लिए दस गुना कम अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, इनक्यूबेशन अवधि को तीन गुना कम कर देता है, समाप्त होने में 1 से 2 सप्ताह लगते हैं, प्रयोगशाला स्थान और अभिकर्मक लागत को कम करता है, और बड़ी संख्या में एमटीबी के साथ काम करने से जुड़े स्वास्थ्य और सुरक्षा जोखिमों को कम करता है। हम प्रस्ताव करते हैं कि इस पद्धति को टीके की प्रभावकारिता निर्धारण के पूर्व-नैदानिक अध्ययनों के लिए सार्वभौमिक रूप से अपनाया जाना चाहिए, जिससे अंततः टीबी के खिलाफ टीकों के विकास में समय कम हो सके। अंत में, सीएफयू गणना की इस अनुकूलित विधि का उपयोग न केवल माइकोबैक्टीरिया बल्कि अन्य बैक्टीरिया, जैसे एस्चेरिचिया कोलाई और राल्स्टोनिया सोलनासेरम21 को निर्धारित करने के लिए किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
टीबी एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या है, जिसका महत्व बढ़ रहा है, खासकर निम्न और मध्यम आय वाले देशों में। COVID-19 महामारी के दौरान टीबी के निदान और उपचार के लिए स्वास्थ्य देखभाल सेटिंग्स में व्यवध?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चिकित्सा संकाय, यूनिवर्सिडेड कैटोलिका पोर्टुगुसा से आंतरिक वित्त पोषण और अनुदान UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020, और EXPL/SAU-INF/0742/2021 के तहत Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) से बाहरी फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
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