결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay
Summary
콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.
Abstract
전 세계적으로 감염원에 의한 주요 사망 원인인 결핵(TB)은 2022년에 160만 명의 목숨을 앗아갔으며, 2019-2021년 팬데믹 기간 동안 COVID-19를 능가했습니다. 이 질병은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis , M.tb)에 의해 발생합니다. 유일한 결핵 백신인 Mycobacterium bovis 균주 Bacillus Calmette-Guérin(BCG)은 세계에서 가장 오래된 허가 백신으로 여전히 사용되고 있습니다. 현재 12개의 백신이 임상시험 중이며 수십 개의 백신이 전임상 개발 중입니다. 전임상 연구에서 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되는 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 분석에 의한 박테리아 콜로니의 계수입니다. 이 시간 소모적인 분석은 결론을 내리는 데 4-6주가 걸리고, 상당한 실험실 및 인큐베이터 공간이 필요하며, 시약 비용이 높고, 오염되기 쉽습니다. 여기서는 M.tb 백신 효능 결과를 분석하기 위한 간단하고 빠른 솔루션을 제공하는 콜로니 계수에 최적화된 방법인 micro-CFU(mCFU)에 대해 설명합니다. mCFU 분석은 10배 적은 시약이 필요하고, 배양 기간을 3배 단축하며, 결론을 내리는 데 1-2주가 소요되며, 실험실 공간 및 시약 비용을 줄이고, 많은 수의 M.tb 작업과 관련된 건강 및 안전 위험을 최소화합니다. 또한, 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 마이코박테리아에 감염된 백신을 접종한 동물의 조직을 포함하여 다양한 출처에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 또한 감염 연구를 위해 단세포, 균일 및 고품질 마이코박테리아 배양을 생산하는 최적화된 방법을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이러한 방법이 백신 효능 결정에 대한 전임상 연구에 보편적으로 채택되어 궁극적으로 결핵 백신 개발 시간을 단축해야 한다고 제안합니다.
Introduction
결핵(TB)은 단일 감염원인인 결 핵균(M.tb)에 의한 전 세계 주요 사망 원인으로, 다른 어떤 병원체보다 더 많은 사람을 사망에 이르게 합니다. 2021년 결핵은 160만 명의 사망자를 발생시켰으며, 2019-2021년 팬데믹 기간 동안 코로나19를 능가했습니다1. 또한 세계보건기구(WHO)의 2022년 전 세계 결핵 보고서에 따르면 코로나19 팬데믹으로 인해 새로운 결핵 사례가 증가했습니다. 세계보건기구(WHO)는 또한 이 기간 동안 결핵 진단을 받은 사람의 수가 크게 감소했다고 보고하고 있으며, 이로 인해 결핵 발병 건수는 더 증가할 수 있다1.
BCG(Bacillus Calmette-Guérin)는 100여 년 전에 백신으로 처음 사용된 병원성 Mycobacterium bovis의 약독화 생균주입니다. 이 백신은 결핵에 대한 유일한 백신이며 세계에서 가장 오래된 허가된 백신으로 여전히 사용되고 있습니다 2,3. 현재 12개의 백신이 서로 다른 임상시험 단계에 있으며4 수십 개의 백신이 전임상 개발 중에 있습니다5,6. 결핵 백신의 전임상 평가에는 안전성 및 면역원성7 평가가 포함되며, 이는 제브라피시, 마우스, 기니피그, 토끼, 소, 비인간 영장류와 같은 다양한 동물 모델에서 얻을 수 있다 8,9,10. 또한, M.tb 감염 및/또는 전염에 대한 보호를 유도하는 백신의 능력, 즉 백신 효능을 평가하기 위해서는 in vivo 5,11에서 M.tb 이의 제기가 필요합니다. 흥미롭게도, BCG 백신 접종은 훈련된 면역 14의 메커니즘을 통해 다른 박테리아 및 바이러스 병원체의 생존에 영향을 미치는 비특이적 효과를 유도한다12,13. 감염된 동물에서 생존 가능한 박테리아 부담을 정량화하기 위해 선택하는 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 분석 5,15를 통해 박테리아 콜로니를 계수하는 것입니다. CFU는 특정 성장 조건에서 군체를 형성하는 미생물(박테리아 또는 곰팡이)의 수를 추정하는 단위입니다. CFU는 생존 가능한 미생물과 복제 가능한 미생물에서 유래하며, 각 군집 내에서 살아있는 미생물의 절대적인 수를 추정하기는 어렵습니다. 군체가 하나 이상의 미생물에서 유래했는지 여부는 불확실합니다. CFU 단위는 이러한 불확실성을 반영하므로 동일한 샘플의 반복실험에서 큰 변동성을 관찰할 수 있습니다. 시간이 많이 소요되는 이 분석에는 생물안전 레벨 3(BSL3) 시설, 상당한 실험실 및 인큐베이터 공간에서 작업하도록 훈련된 전문 기술자가 필요하며, 결론을 내리는 데 4주에서 6주가 소요되며 오염되기 쉽습니다.
이 연구에서는 콜로니 계수에 최적화된 방법인 micro-CFU(mCFU)를 설명하고 결과 15,16,17,18,19,20을 분석하기 위한 간단하고 빠른 솔루션을 제공합니다. mCFU 분석은 10배 적은 시약이 필요하고, 배양 기간을 3배 단축하며, 결론을 내리는 데 1-2주가 소요되며, 실험실 공간 및 시약 비용을 줄이고, 많은 수의 M.tb 작업과 관련된 건강 및 안전 위험을 최소화합니다. 우리는 이 방법이 백신 효능 결정에 대한 전임상 연구에 보편적으로 채택되어야 하며, 궁극적으로 결핵 백신 개발 시간을 단축할 것을 제안합니다. 마지막으로, 이 최적화된 CFU 계수 방법은 마이코박테리아뿐만 아니라 대장균(Escherichia coli) 및 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum21)과 같은 다른 박테리아도 정량화하는 데 사용되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
결핵은 특히 저소득 및 중간 소득 국가에서 그 중요성이 커지고 있는 중요한 공중 보건 문제입니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 결핵을 진단하고 치료하기 위한 의료 환경의 붕괴는 신규 사례 발생률에 부정적인 영향을 미쳤습니다1. 또한, 이 전염병을 통제하기 위해서는 다제내성 및 광범위한 약물 내성 M.tb 균주, M.tb와 HIV의 동시 감염이 시급히 해결되어야 한다<sup cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 및 EXPL/SAU-INF/0742/2021 보조금에 따라 Universidade Católica Portuguesa 의과대학의 내부 자금과 Fundação para a Ciência e a Tecnologia(FCT)의 외부 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
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