Mikrokolonibildande enhetsanalys för effektutvärdering av vacciner mot tuberkulos
Summary
Bestämning av kolonibildande enheter (CFU) är den gyllene standardtekniken för att kvantifiera bakterier, inklusive Mycobacterium tuberculosis som kan ta veckor att bilda synliga kolonier. Här beskriver vi en mikro-CFU för CFU-bestämning med ökad tidseffektivitet, minskat labbutrymme och reagenskostnad samt skalbarhet till medelstora och höga genomströmningsexperiment.
Abstract
Tuberkulos (TBC), den vanligaste dödsorsaken i världen på grund av ett smittämne, dödade 1,6 miljoner människor 2022 och överträffades endast av covid-19 under pandemin 2019–2021. Sjukdomen orsakas av bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Mycobacterium bovis-stammen Bacillus Calmette-Guérin (BCG), det enda tuberkulosvaccinet, är det äldsta licensierade vaccinet i världen och används fortfarande. För närvarande finns det 12 vacciner i kliniska prövningar och dussintals vacciner under preklinisk utveckling. Den metod som används för att bedöma effekten av tuberkulosvacciner i prekliniska studier är att räkna bakteriekolonier med hjälp av CFU-analysen. Denna tidskrävande analys tar 4 till 6 veckor att slutföra, kräver betydande laboratorie- och inkubatorutrymme, har höga reagenskostnader och är benägen att kontamineras. Här beskriver vi en optimerad metod för uppräkning av kolonier, mikro-CFU (mCFU), som erbjuder en enkel och snabb lösning för att analysera M.tb-vaccinets effektivitetsresultat. mCFU-analysen kräver tio gånger färre reagenser, minskar inkubationstiden trefaldigt, tar 1 till 2 veckor att slutföra, minskar laboratorieutrymmet och reagenskostnaderna och minimerar hälso- och säkerhetsriskerna förknippade med att arbeta med ett stort antal M.tb. För att utvärdera effekten av ett tuberkulosvaccin kan prover dessutom tas från en mängd olika källor, inklusive vävnader från vaccinerade djur som infekterats med mykobakterier. Vi beskriver också en optimerad metod för att producera en encellig, enhetlig och högkvalitativ mykobakteriekultur för infektionsstudier. Slutligen föreslår vi att dessa metoder ska användas universellt för prekliniska studier av bestämning av vaccineffektivitet, vilket i slutändan leder till tidsförkortning i utvecklingen av vacciner mot tuberkulos.
Introduction
Tuberkulos (TBC) är den vanligaste dödsorsaken i världen på grund av ett enda smittämne, bakterien Mycobacterium tuberculosis (M.tb), som dödar fler människor än någon annan patogen. År 2021 orsakade tuberkulos 1,6 miljoner dödsfall och överträffades av covid-19 under pandemin 2019–20211. Enligt Världshälsoorganisationens globala tuberkulosrapport från 2022 var covid-19-pandemin dessutom ansvarig för en ökning av antalet nya tuberkulosfall. WHO rapporterar också stora minskningar av antalet personer som diagnostiserats med tuberkulos under denna period, vilket kan öka antalet tuberkulosfallytterligare.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) är en levande försvagad stam av den patogena Mycobacterium bovis, som användes för första gången som vaccin för mer än 100 år sedan. Detta är det enda vaccinet mot tuberkulos och är det äldsta licensierade vaccinet i världen som fortfarande används 2,3. För närvarande finns det 12 vacciner i olika faser av kliniska prövningar4, och dussintals vacciner är under preklinisk utveckling 5,6. Preklinisk bedömning av vacciner mot tuberkulos omfattar utvärdering av säkerhet och immunogenicitet7, som kan erhållas i olika djurmodeller såsom zebrafiskar, möss, marsvin, kaniner, nötkreatur och icke-mänskliga primater 8,9,10. För att bedöma ett vaccins förmåga att inducera skydd mot M.tb-infektion och/eller överföring, dvs. vaccinets effektivitet, krävs dessutom en M.tb-provokation in vivo 5,11. Intressant nog inducerar BCG-vaccination icke-specifika effekter som påverkar överlevnaden av andra bakteriella och virala patogener 12,13 genom mekanismen för tränad immunitet14. För att kvantifiera den livskraftiga bakteriebördan hos ett infekterat djur är den valda metoden att räkna bakteriekolonier genom CFU-analysen (Colony-Forming Units) 5,15. CFU är en enhet som uppskattar antalet mikroorganismer (bakterier eller svampar) som bildar kolonier under specifika tillväxtförhållanden. CFU härstammar från livskraftiga och replikativa mikroorganismer, och det absoluta antalet levande mikroorganismer inom varje koloni är svårt att uppskatta. Det är osäkert om en koloni har sitt ursprung i en eller flera mikroorganismer. CFU-enheten återspeglar denna osäkerhet, vilket innebär att en stor variabilitet kan observeras hos replikat av samma prov. Denna tidskrävande analys kräver specialiserade tekniker som är utbildade för att arbeta i en anläggning med biosäkerhetsnivå 3 (BSL3), ett stort laboratorie- och inkubatorutrymme, tar från 4 till 6 veckor att slutföra och är benägen att kontamineras.
I denna studie beskriver vi en optimerad metod för populationsräkning, micro-CFU (mCFU), och erbjuder en enkel och snabb lösning för att analysera resultaten 15,16,17,18,19,20. mCFU-analysen kräver tio gånger färre reagenser, minskar inkubationstiden trefaldigt, tar 1 till 2 veckor att slutföra, minskar laboratorieutrymmet och reagenskostnaderna och minimerar hälso- och säkerhetsriskerna förknippade med att arbeta med ett stort antal M.tb. Vi föreslår att denna metod ska användas universellt för prekliniska studier av bestämning av vaccineffektivitet, vilket i slutändan leder till tidsförkortning i utvecklingen av vacciner mot tuberkulos. Slutligen har denna optimerade metod för CFU-räkning använts för att kvantifiera inte bara mykobakterier utan även andra bakterier, såsom Escherichia coli och Ralstonia solanacearum21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tuberkulos är ett stort folkhälsoproblem som blir allt viktigare, särskilt i låg- och medelinkomstländer. Störningarna i hälso- och sjukvården för att diagnostisera och behandla tuberkulos under covid-19-pandemin hade en negativ inverkan på förekomsten av nya fall1. Dessutom måste man snarast ta itu med multiresistenta och i stor utsträckning läkemedelsresistenta tuberkulosstammar och samtidig infektion av tuberkulos och hiv för att få bukt med denna epidemi<sup c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av intern finansiering från Medicinska fakulteten, Universidade Católica Portuguesa, och extern finansiering från Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), under bidragen UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 och EXPL/SAU-INF/0742/2021.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
Riferimenti
- World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
