Detta protokoll presenterar ett transpupillär synstyrt transskleralt tillvägagångssätt för att säkert och exakt leverera subretinala cellulära transplantat, med en låg frekvens av kirurgiska komplikationer, i musmottagare med eller utan retinal degeneration.
Transplantation av fotoreceptorceller och retinala pigmentepitelceller (RPE) ger en potentiell behandling för näthinnedegenerationssjukdomar. Subretinal transplantation av terapeutiska donatorceller till musmottagare är utmanande på grund av det begränsade kirurgiska utrymme som tillåts av musögats lilla volym. Vi utvecklade en transskleral kirurgisk transplantationsplattform med direkt transpupillär synvägledning för att underlätta subretinal leverans av exogena celler i musmottagare. Plattformen testades med hjälp av retinala cellsuspensioner och tredimensionella näthinneark insamlade från stavrika Rho:: EGFP-möss och konrika OPN1LW-EGFP; NRL-/- möss, respektive. Levande/död analys visade låg cellmortalitet för båda formerna av donatorceller. Retinala transplantat levererades framgångsrikt till det subretinala utrymmet i en musmodell av retinal degeneration, Rd1/NS, med minimala kirurgiska komplikationer som upptäcktes med multimodalt konfokalt skanningslaseroftalmoskop (cSLO) avbildning. Två månader efter transplantationen visade histologisk färgning tecken på avancerad mognad av näthinnetransplantaten till “vuxna” stavar och tappar (genom robust Rho::EGFP-, S-opsin- respektive OPN1LW:EGFP-uttryck) i det subretinala utrymmet. Här tillhandahåller vi en kirurgisk plattform som kan möjliggöra mycket exakt subretinal förlossning med en låg frekvens av komplikationer hos musmottagare. Denna teknik erbjuder precision och relativt enkel färdighetsinlärning. Dessutom skulle tekniken kunna användas inte bara för studier av subretinal celltransplantation utan även för andra intraokulära terapeutiska studier inklusive genterapier.
Transplantation av fotoreceptorer och retinala pigmenterade epitelceller (RPE) ger potentiell behandling för retinala degenerativa sjukdomar som åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), Stargardts sjukdom och retinitis pigmentosa (RP)1,2,3,4,5,6,7 . För att fylla på eller ersätta de sjuka fotoreceptorerna och RPE-cellerna i degenererade näthinnor är det subretinala utrymmet särskilt väl lämpat som transplantationsmål med tanke på den laminära anatomin hos värdfotoreceptorer och RPE-celler. Även om kirurgiska ingrepp för subretinal transplantation av RPE-celler är väletablerade i stora djur 8,9,10 och kliniska prövningar 11,12,13, är utmaningarna för forskning om fotoreceptortransplantation bland annat bristen på transgena stordjursmodeller och den begränsade förståelsen av djupgående synaptogenesmekanismer som är involverade i neuronal transplantation. Genetiskt modifierade murina modeller, med olika typer av retinala degenerationsmutanter, ger användbara verktyg för att studera molekylära mekanismer i samband med transplantation och styra utvecklingen av effektiva cellersättningsterapier i det prekliniska stadiet 14,15,16,17,18.
Till skillnad från det relativt stora ögat och den lilla kristallina linsen hos stora djur (t.ex. gris, apa), gör den lilla storleken och stora kristallina linsen i musögon dem till svåra kirurgiska mål, särskilt för subretinal transplantation där fysiska utrymmesbegränsningar och begränsad direkt visualisering är de centrala utmaningarna.
Nuvarande tillvägagångssätt kan klassificeras i tre huvudtyper baserat på injektionsvägen. Först, när det gäller transhornhinnan, förs nålen genom hornhinnan in i glaskroppen och sedan in i det subretinala utrymmet19,20. Framgångsrik subretinal tillförsel kan uppnås med denna metod, men skador på främre segmentstrukturer (dvs. hornhinna, iris, lins) är en stor risk som allvarligt kan hindra nedströms in vivo-analys. För det andra, i fallet med det transglasartade tillvägagångssättet, går nålen in i glaskroppen genom pars plana och sedan in i det subretinala utrymmet21. Detta tillvägagångssätt används ofta hos människor och stora djur. Det finns dock en potentiell risk för linsskador hos gnagare eftersom linsen upptar en större relativ volym av glaskroppen. Noterbart är att både transhornhinne- och transglaskroppsprotokoll kräver penetration av den neurala näthinnan för att komma fram till det subretinala utrymmet, vilket orsakar skador på värdnäthinnan och ökar risken för donatorcellsreflux genom penetrationshålet. För det tredje, i fallet med det transsklerala tillvägagångssättet22,23, tränger nålen igenom det skleral-koroid-RPE-komplexet och går direkt in i det subretinala utrymmet. Detta tillvägagångssätt minskar det potentiella traumat av främre segmentstrukturer och glaskroppshålan. Men utan direkt visualisering av värdfundus upptäcks ofta kirurgiska fel orsakade av transretinala punkteringar, RPE-avlossning och koroidblödning.
Här utvecklade vi en transskleral kirurgisk plattform med direkt transpupillär synvägledning för subretinal transplantation hos musmottagare. Validering av livsdugligheten hos donatorns näthinneark och cellsuspensioner före transplantation utfördes. Framgångsrik leverans av donatorcellerna till det subretinala utrymmet i en modell av en modell av näthinnedegeneration bekräftades. Endast sällsynta kirurgiska komplikationer upptäcktes. Dessutom överlevde transplanterade fotoreceptorer i näthinnetransplantaten och visade tecken på avancerad mognad till “vuxna” stavar och tappar två månader efter transplantationen.
Subretinal transplantation på möss är tekniskt utmanande på grund av musögonens ringa storlek. I denna studie utvecklade vi en enkel och reproducerbar plattform för subretinal transplantation i musmottagare. Plattformen möjliggör konsekvens i donatorns viabilitetsskydd, framgångsrik subretinal tillförsel och säkerställer en låg komplikationsfrekvens.
Den subretinala transplantationstekniken som avbildas här utvecklades baserat på den transsklerala vägen, där injektionsnålen penetrerar de yttre lagren (sclera-choroid-RPE-komplexet) i ögonväggen. Jämfört med transhornhinnan19,20 och transglaskroppen21,26,27 går den transsklerala metoden direkt in i det subretinala utrymmet utan att penetrera de främre segmentstrukturerna och den neurala näthinnan, vilket möjliggör en ofarlig transplantation och minskar risken för reflux av donatorceller genom det penetrerande hålet. En utmaning med det transsklerala tillvägagångssättet är att säkerställa att nålspetsen fortplantar sig längs det subretinala utrymmet innan den anländer till terminalleveransplatsen, samtidigt som man undviker potentiell störning av de intilliggande RPE- och åderhinnelagren. Det är en utmaning att uppnå dessa mål genom ett traditionellt transskleralt tillvägagångssätt28,29 utan direkt visuell vägledning. I denna studie utvecklade vi en transpupillär synstyrd plattform med hjälp av ett kirurgiskt mikroskop och extern belysning av näthinnan för att underlätta subretinal transplantation i musmodeller. Plattformen gör det möjligt för operatören att spåra den kirurgiska processen och mottagarnas näthinnetillstånd genom att tillhandahålla realtidsvisualisering av mottagarens ögonbotten under det kirurgiska mikroskopet. Till exempel kan framgångsrik penetration av sklera-choroid-RPE-komplexet enkelt valideras genom en relativt ljus reflektion av nålspetsen via transpupillvisualisering. Det är viktigt att operatören, när han eller hon styrs av transpupillvisualisering, exakt kan modulera vinkeln och injektionsdjupet i enlighet med den relativa positionen mellan nålen och anatomiska strukturer i mottagarens näthinna (t.ex. näthinnekärl och synnervshuvud). Dessutom kan korrekt administrering av material med denna teknik minimera RPE, åderhinnetrauma och andra kirurgiska komplikationer. Vi fann att blödningar kan minimeras genom att undvika manövrar i närheten av näthinnans blodkärl med hjälp av transpupillvisualisering.
Reflux av donatorceller är en viktig orsak till kirurgisk svikt efter injektion29,30. Det finns flera faktorer som är involverade i att främja reflux från donatorceller. Det höga intraokulära trycket (IOP) i mottagarögonen som orsakas av de injicerade donatorcellblandningarna är en viktig faktor som främjar återflödet av celler ut ur ögat. Vårt protokoll minskar mottagarnas IOP genom penetration av främre kammaren i början av operationen och gör det möjligt för IOP att sänkas spontant genom vattenhaltig vätskeutträngning innan glaskroppen dras ut från glaskroppen. En andra faktor är den oförseglade injektionstunneln i mottagarnas ögon. För att förhindra transplantatåterflöde tillbaka genom injektionstunneln använder vi en liten mikroinjektionsnål (34G) för att skapa en självtätande tunnel när vi penetrerar ögonväggen och en tandad mikropincett för att hålla kanterna på den yttre tunnelöppningen när vi drar ut nålen. Vid konventionell transplantation upptäcks knappt refluxtransplantat eftersom de kan uppstå snabbt eller försvinna snabbt. Natriumhyaluronatet, vid applicering av täckglaset, glider nästan alltid av hornhinnan för att täcka det mesta av limbus och sclera inklusive sklerotomistället. Efter cellinjektion kan natriumhyaluronatet vid sklerotomistället hjälpa till att bromsa bulkflödet av refluxat innehåll, om något, och hjälpa till att göra dem visuellt detekterbara under det kirurgiska mikroskopet. Dessutom kan frånvaron av reflux också verifieras genom att spåra konstansen hos den subretinala bleben för cellsuspensioner och den intraokulära placeringen av näthinnearket med hjälp av vårt protokoll, vilket kan vara användbart för laboratorier där optisk koherenstomografi (OCT) inte är tillgänglig.
Även om ett stort antal fotoreceptorceller överlevde i de transplanterade näthinnearken, kunde ingen urskiljbar cellulär orientering eller arkorientering detekteras. Även om leverans av 3D-näthinneark till stora djur har etablerats 26,31,32, gör det subretinala utrymmet hos möss, tillsammans med bristen på intraoperativ näthinneavbildningsförmåga, det mycket utmanande att säkerställa upprätthållandet av arkorientering intraoperativt såväl som under den omedelbara postoperativa perioden under vilken de transplanterade cellerna eller arken kan bli instabila när musen återfår rörlighet.
Vi beskriver en transskleral kirurgisk plattform med direkt transpupillär synvägledning för subretinal transplantation hos musmottagare. Denna plattform möjliggör hög injektionsnoggrannhet och en låg frekvens av kirurgiska komplikationer. Denna plattform möjliggör exakt leverans av kända doser av celler, är relativt lätt att lära sig och underlättar subretinal tillförsel utöver intraretinala eller intravitreala injektioner för olika typer av terapeutiska medel inklusive genterapi.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av följande medel: NEI R01EY033103 (MSS), Foundation Fighting Blindness (MSS), Shulsky Foundation (MSS), Joseph Albert Hekimian Fund (MSS), Juliette RP Vision Foundation (YVL), Research to Prevent Blindness (obegränsat bidrag till Wilmer Eye Institute vid Johns Hopkins University och Cullen Eye Institute vid Baylor College of Medicine). Vi tackar Dr. Malia Edwards (Johns Hopkins University School of Medicine) för att hon vänligen gav utbildning i mikroskopet.
Artificial tears | CareAll | P31447-04 | |
Coverslips (5mm in diameter) | Deckglaser | N/A | |
Goat anti-GFP (FITC) | Abcam | Ab6662 | |
Goat-anti-rabbit Cy3 | Invitrogen | A10520 | |
Insulin syringe (30G) | Easy Touch | 08496-3015-11 | |
Ketamine | VETone Zetamine | AH2017J | |
Live Dead Viability Kit | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
Micro scissor | Harvard Apparatus | 72-8503 | |
Micro smooth forceps | ASICO | AE-4360 | |
Micro toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
Microinjection needle (26G) | Hamilton | 7804-03 | |
Microinjection needle (34G) | Hamilton | 207434 | |
Microinjection syringe | Hamilton | 7633-01 | |
Papain dissociation kit | Worthington Biochemical | LK003150 | |
Petri-dish (35 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB012920 | |
Povidone-iodine (10%) | Betadine Solution | N/A | |
Proparacaine Hydrochloride (0.5%) | Keeler | AX0500 | |
Rabbit anti-recoverin | Millipore | Ab5585 | |
Rabbit anti-S-opsin | Millipore | Ab5407 | |
Sodium hyaluronate | Johnson & Johnson Vision | 10-2400-11 | |
Sterile cotton swabs | Puritan | 25-806 2PC | |
Sterile needle (25G) | BD PrecisionGlide Needle | 305122 | |
Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
Surgical materials/reagents | |||
Tropicamide ophthalmic solution | Henry Schein | 112-7192 | |
Xylazine | AnaSed Injection | N/A |