Optimeret automatiseret analyse af levende neuronal mitokondriehomeostasemodulation ved isoformspecifikke retinsyrereceptorer
Summary
Mitokondrienetværket er ekstremt komplekst, hvilket gør det meget udfordrende at analysere. Et nyt MATLAB-værktøj analyserer levende konfokale mitokondrier i timelapse-billeder, men resulterer i en stor outputvolumen, der kræver individuel manuel opmærksomhed. For at løse dette problem blev der udviklet en rutineoptimering, der muliggør hurtig filanalyse.
Abstract
Det komplekse mitokondrienetværk gør det meget udfordrende at segmentere, følge og analysere levende celler. MATLAB-værktøjer tillader analyse af mitokondrier i timelapse-filer, hvilket forenkler og fremskynder billedbehandlingsprocessen betydeligt. Ikke desto mindre producerer eksisterende værktøjer en stor outputvolumen, der kræver individuel manuel opmærksomhed, og grundlæggende eksperimentelle opsætninger har et output på tusindvis af filer, der hver kræver omfattende og tidskrævende håndtering.
For at løse disse problemer blev der udviklet en rutinemæssig optimering i både MATLAB-kode og live-script-formularer, hvilket giver mulighed for hurtig filanalyse og reducerer dokumentlæsning og databehandling betydeligt. Med en hastighed på 100 filer / min muliggør optimeringen en samlet hurtig analyse. Optimeringen opnår resultaterne output ved at beregne gennemsnittet af rammespecifikke data for individuelle mitokondrier gennem tidsrammer og analysere data på en defineret måde, i overensstemmelse med output fra eksisterende værktøjer. Live konfokal billeddannelse blev udført ved anvendelse af farvestoffet tetramethylrhodaminmethylester, og den rutinemæssige optimering blev valideret ved behandling af neuronale celler med retinsyrereceptoragonister (RAR), hvis virkninger på neuronale mitokondrier er fastlagt i litteraturen. Resultaterne var i overensstemmelse med litteraturen og tillod yderligere karakterisering af mitokondrienetværksadfærd som reaktion på isoformspecifik RAR-modulering.
Denne nye metode tillod hurtig og valideret karakterisering af mitokondrienetværk for hele neuron, men det giver også mulighed for differentiering mellem axon og cellelegememitokondrier, en væsentlig funktion at anvende inden for neurovidenskabsområdet. Desuden kan denne protokol anvendes til eksperimenter ved hjælp af hurtigtvirkende behandlinger, hvilket muliggør billeddannelse af de samme celler før og efter behandlinger, der overskrider neurovidenskabens område.
Introduction
Cellulære mitokondrier sidder i centrum for alle fysiologiske tilstande, og en grundig forståelse af deres homeostase (mitostase) og adfærd er afgørende for at hjælpe med at identificere farmakologisk behandling for en lang række sygdomme, herunder kræft og Alzheimers sygdom 1,2.
Mitokondrier spiller afgørende cellulære roller i energihomeostase, ATP-generering, calciumbuffering og ROS-regulering, og mitostase er afgørende for at opretholde proteinhomeostase, da molekylære chaperoner er energiafhængige3. Disse kræver en konstant og dynamisk netværksmodulering og tilpasning for effektivt at imødekomme cellulære behov, og mitokondrietransport reguleres af forskellige signalveje; Tidligere arbejde har beskrevet en sådan vej, nemlig retinsyrereceptorer (RAR’er)4,5. Retinsyre (RA) fremmer aksonal og neurit udvækst via RAR aktivering. I mus primære kortikale neuroner, aktivering af RAR-β fremmer mitokondriel vækst, hastighed, og mobilitet i neurit6.
I betragtning af mitokondrienetværkets tilpasningsevne og dynamik er muligheden for at vurdere mitostase i “realtid” afgørende ikke kun for at undersøge energihomeostase, men også for proteostase, cellulær sundhed, spredning eller signalering. En almindeligt anvendt metode til evaluering af mitostase er afhængig af konfokal mikroskopi efter fremhævning af mitokondrier ved anvendelse af et fluorescerende farvestof eller markør samt en specifik mikroskopiopsætning, der tillader temperatur og / eller CO2 -regulering7. Denne type eksperimentel opsætning indebærer, at der udføres én eksperimentel replikat ad gangen. Ud over eksperimentel gentagelse af forskellige behandlinger bør det overvejes, at de fleste eksperimenter bør have deres tekniske replikater (hvor mere end en position er afbildet pr. Plade), hvor en række brændplaner (z-stakke) registreres i en række tidspunkter. Således resulterer et eksperimentelt design med tre gentagelser af en kontrol og to behandlinger med fem billeddannelsespositioner pr. plade og 15 tidspunkter i 225 stakke, der skal behandles. Klassisk blev videoer af levende mitokondrier analyseret ved at plotte kymografer, som ville blive analyseret individuelt8, i en tidskrævende proces, der kræver omfattende manuel input, selv når man stoler på computerværktøjer.
En algoritme blev for nylig beskrevet9 , der tillader automatiseret segmentering og sporing af mitokondrier i live-celle 2-D og 3-D time-lapse filer. Andre kvantificeringsteknikker er tilgængelige, og alle har deres begrænsninger10. Mitometer, en automatiseret open source-applikation, er især velegnet til time lapse og mitokondriedynamikanalyse, der kræver lavt brugerinput. Denne applikation har en række fordele i forhold til andre eksisterende MATLAB-baserede værktøjer, nemlig at tillade automatisk behandling af individuelle TIF-stakke ved hjælp af op til 13 forskellige parametre, især interessante for neurovidenskab, da den skelner mellem peri- og telenukleare mitokondrier.
For et eksperiment som det ovenfor beskrevne resulterer disse 13 parametre anvendt på 225 stakke imidlertid i 2.925 individuelle outputfiler. Disse kræver fire individuelle computerindgange, som tilsammen giver over 10.000 manuelle indgange, der kræves for at downloade alle outputfiler. For store eksperimentelle designs resulterer dette i en unødvendig ekstremt tidskrævende analyse af hver fil og dataintegration. Heri præsenterer vi en rutineoptimering, der muliggør hurtig filanalyse, hvilket i høj grad reducerer dokumentlæsning og databehandling, analyserer data på en defineret måde i overensstemmelse med output fra eksisterende værktøjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Live cellebilleddannelse producerer store filer, der kræver seriøs databehandling, men selv de nyeste værktøjer kræver omfattende manuel input for at behandle. Denne rutinemæssige optimering er fokuseret på at forenkle processen med mitokondrieanalyse på Mitometeret, fordi dette værktøj præsenterer en meget god balance mellem brugerinput og dataoutput. En omfattende sammenligning mellem forskellige værktøjer til mitokondriebilledanalyse er tidligere blevet gennemgået10. Mens andre r?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Billedoptagelse blev udført i LiM-faciliteten hos iBiMED, en node i PPBI (Portuguese Platform of BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Dette arbejde blev støttet af FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), et tilskud til DT fra Fundação para a Ciência e Tecnologia under Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), et tilskud fra ATG-The Gabba Alumni Association til VP og Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Riferimenti
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -. H., Tseng, W. -. W., Hsu, C. -. M., Wei, A. -. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
