Geoptimaliseerde geautomatiseerde analyse van homeostasemodulatie van levende neuronale mitochondriën door isovormspecifieke retinoïnezuurreceptoren
Summary
Het mitochondriale netwerk is uiterst complex, waardoor het zeer uitdagend is om te analyseren. Een nieuwe MATLAB-tool analyseert live confocale mitochondriën in timelapse-beelden, maar resulteert in een groot uitvoervolume dat individuele handmatige aandacht vereist. Om dit probleem aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is.
Abstract
Het complexe mitochondriale netwerk maakt het zeer uitdagend om levende cellen te segmenteren, te volgen en te analyseren. MATLAB-tools maken de analyse van mitochondriën in timelapse-bestanden mogelijk, waardoor het proces van beeldverwerking aanzienlijk wordt vereenvoudigd en versneld. Desalniettemin produceren bestaande tools een groot uitvoervolume, dat individuele handmatige aandacht vereist, en experimentele basisopstellingen hebben een uitvoer van duizenden bestanden, die elk een uitgebreide en tijdrovende verwerking vereisen.
Om deze problemen aan te pakken, werd een routinematige optimalisatie ontwikkeld, zowel in MATLAB-code als in live-script-vormen, waardoor een snelle bestandsanalyse mogelijk is en het lezen en verwerken van documenten aanzienlijk wordt verminderd. Met een snelheid van 100 bestanden/min maakt de optimalisatie een algehele snelle analyse mogelijk. De optimalisatie bereikt de resultaten door het gemiddelde te nemen van framespecifieke gegevens voor individuele mitochondriën gedurende tijdsbestekken, waarbij gegevens op een gedefinieerde manier worden geanalyseerd, consistent met die uitvoer van bestaande tools. Live confocale beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van de kleurstof tetramethylrhodaminemethylester, en de routinematige optimalisatie werd gevalideerd door neuronale cellen te behandelen met retinoïnezuurreceptor (RAR)-agonisten, waarvan de effecten op neuronale mitochondriën in de literatuur zijn vastgesteld. De resultaten waren consistent met de literatuur en maakten verdere karakterisering van het gedrag van mitochondriale netwerken mogelijk als reactie op isovormspecifieke RAR-modulatie.
Deze nieuwe methodologie maakte een snelle en gevalideerde karakterisering van het mitochondriënnetwerk van hele neuronen mogelijk, maar het maakt ook differentiatie mogelijk tussen axon- en cellichaammitochondriën, een essentieel kenmerk om toe te passen op het gebied van neurowetenschappen. Bovendien kan dit protocol worden toegepast op experimenten met snelwerkende behandelingen, waardoor dezelfde cellen voor en na behandelingen kunnen worden afgebeeld, wat het gebied van de neurowetenschappen overstijgt.
Introduction
Cellulaire mitochondriën bevinden zich in het centrum van alle fysiologische toestanden, en een grondig begrip van hun homeostase (mitostase) en gedrag is van het grootste belang om te helpen bij het identificeren van farmacologische behandeling voor een breed scala aan ziekten, waaronder kanker en de ziekte van Alzheimer 1,2.
Mitochondriën spelen een cruciale cellulaire rol bij energiehomeostase, ATP-generatie, calciumbuffering en ROS-regulatie, en mitostase is essentieel voor het handhaven van eiwithomeostase, aangezien moleculaire chaperonnes energieafhankelijk zijn3. Deze vereisen een constante en dynamische netwerkmodulatie en -aanpassing om efficiënt aan de cellulaire behoeften te voldoen, en het transport van mitochondriën wordt gereguleerd door verschillende signaalroutes; Eerder werk heeft zo’n route beschreven, die van retinoïnezuurreceptoren (RAR’s)4,5. Retinoïnezuur (RA) bevordert axonale en neurietuitgroei via RAR-activering. In primaire corticale neuronen van muizen stimuleert activering van RAR-β mitochondriale groei, snelheid en mobiliteit in de neuriet6.
Gezien het aanpassingsvermogen en de dynamiek van het mitochondriale netwerk, is de mogelijkheid om mitostase in “realtime” te beoordelen essentieel, niet alleen voor het onderzoeken van energiehomeostase, maar ook voor proteostase, cellulaire gezondheid, proliferatie of signalering. Een veelgebruikte methode voor het evalueren van mitostase is gebaseerd op confocale microscopie na het markeren van mitochondriën met behulp van een fluorescerende kleurstof of marker, evenals een specifieke microscopie-opstelling die temperatuur- en/of CO2 -regulatie mogelijkmaakt 7. Dit type experimentele opstelling houdt in dat één experimentele replicatie tegelijk wordt uitgevoerd. Naast experimentele herhaling van verschillende behandelingen, moet er rekening mee worden gehouden dat de meeste experimenten hun technische replica’s moeten hebben (waarbij meer dan één positie per plaat wordt afgebeeld), waarbij een reeks brandpuntsvlakken (z-stacks) wordt geregistreerd in een reeks tijdstippen. Een experimenteel ontwerp met drie herhalingen van één controle en twee behandelingen, met vijf beeldvormingsposities per plaat en 15 tijdstippen, resulteert dus in 225 te verwerken stapels. Klassiek werden video’s van levende mitochondriën geanalyseerd door kymografen uit te zetten, die individueel zouden worden geanalyseerd8, in een tijdrovend proces dat uitgebreide handmatige invoer vereiste, zelfs wanneer men vertrouwde op computerhulpmiddelen.
Onlangs is een algoritme beschreven9 dat geautomatiseerde segmentatie en tracking van mitochondriën in live-cell 2D- en 3D-time-lapse-bestanden mogelijk maakt. Er zijn andere kwantificeringstechnieken beschikbaar, die allemaal hun beperkingen hebben10. Mitometer, een geautomatiseerde open-source applicatie, is met name geschikt voor time-lapse en analyse van de dynamiek van mitochondriën, waarvoor een lage gebruikersinput nodig is. Deze toepassing heeft een reeks voordelen ten opzichte van andere bestaande MATLAB-gebaseerde tools, namelijk het mogelijk maken van de automatische verwerking van individuele TIF-stacks, met behulp van maximaal 13 verschillende parameters, vooral interessant voor neurowetenschappen, omdat het onderscheid maakt tussen peri- en telenucleaire mitochondriën.
Voor een experiment zoals hierboven beschreven, resulteren deze 13 parameters toegepast op 225 stapels echter in 2.925 individuele uitvoerbestanden. Deze vereisen vier afzonderlijke computerinvoer, wat neerkomt op meer dan 10.000 handmatige invoer die nodig is om alle uitvoerbestanden te downloaden. Voor grote experimentele ontwerpen resulteert dit in een onnodig extreem tijdrovende analyse van elk bestand en data-integratie. Hierin presenteren we een routinematige optimalisatie die een snelle bestandsanalyse mogelijk maakt, het lezen en verwerken van documenten aanzienlijk vermindert, en gegevens op een gedefinieerde manier analyseert, consistent met de output van bestaande tools.
Protocol
Representative Results
Discussion
Live cell imaging produceert grote bestanden die serieuze computerverwerking vereisen, maar zelfs de meest recente tools vereisen uitgebreide handmatige invoer om te verwerken. Deze routinematige optimalisatie is gericht op het vereenvoudigen van het proces van mitochondriënanalyse op de Mitometer, omdat deze tool een zeer goede balans biedt tussen gebruikersinvoer en gegevensuitvoer. Een uitgebreide vergelijking tussen verschillende tools voor beeldanalyse van mitochondriën is eerder besproken10</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De beeldacquisitie werd uitgevoerd in de LiM-faciliteit van iBiMED, een knooppunt van PPBI (Portugees Platform voor BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Dit werk werd ondersteund door FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), een subsidie aan DT van de Fundação para a Ciência e Tecnologia van het Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), een subsidie van ATG-The Gabba Alumni Association aan VP, en het Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Riferimenti
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -. H., Tseng, W. -. W., Hsu, C. -. M., Wei, A. -. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
