आइसोफॉर्म-विशिष्ट रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर्स द्वारा लाइव न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया होमियोस्टेसिस मॉड्यूलेशन का अनुकूलित स्वचालित विश्लेषण
Summary
माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क बेहद जटिल है, जिससे विश्लेषण करना बहुत चुनौतीपूर्ण हो जाता है। एक उपन्यास MATLAB उपकरण टाइमलैप्स छवियों में लाइव कॉन्फोकल इमेज वाले माइटोकॉन्ड्रिया का विश्लेषण करता है, लेकिन इसके परिणामस्वरूप एक बड़ी आउटपुट वॉल्यूम होती है जिसके लिए व्यक्तिगत मैनुअल ध्यान देने की आवश्यकता होती है। इस समस्या को हल करने के लिए, एक नियमित अनुकूलन विकसित किया गया था, जिससे त्वरित फ़ाइल विश्लेषण की अनुमति मिलती है।
Abstract
जटिल माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क जीवित कोशिकाओं को खंडित करने, उनका पालन करने और उनका विश्लेषण करने के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण बनाता है। MATLAB उपकरण टाइमलैप्स फ़ाइलों में माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषण की अनुमति देते हैं, छवि प्रसंस्करण की प्रक्रिया को काफी सरल और तेज करते हैं। बहरहाल, मौजूदा उपकरण एक बड़ी आउटपुट मात्रा का उत्पादन करते हैं, जिसके लिए व्यक्तिगत मैनुअल ध्यान की आवश्यकता होती है, और बुनियादी प्रयोगात्मक सेटअप में हजारों फाइलों का आउटपुट होता है, प्रत्येक को व्यापक और समय लेने वाली हैंडलिंग की आवश्यकता होती है।
इन मुद्दों को हल करने के लिए, MATLAB कोड और लाइव-स्क्रिप्ट दोनों रूपों में एक नियमित अनुकूलन विकसित किया गया था, जिससे स्विफ्ट फ़ाइल विश्लेषण की अनुमति मिलती है और दस्तावेज़ पढ़ने और डेटा प्रोसेसिंग को काफी कम किया जाता है। मिनट की गति के साथ, अनुकूलन एक समग्र तेजी से विश्लेषण की अनुमति देता है। अनुकूलन समय सीमा के दौरान व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के लिए फ्रेम-विशिष्ट डेटा का औसत करके परिणाम आउटपुट प्राप्त करता है, एक परिभाषित तरीके से डेटा का विश्लेषण करता है, जो मौजूदा उपकरणों से उन आउटपुट के अनुरूप होता है। डाई टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर का उपयोग करके लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग का प्रदर्शन किया गया था, और नियमित अनुकूलन को रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर (आरएआर) एगोनिस्ट के साथ न्यूरोनल कोशिकाओं का इलाज करके मान्य किया गया था, जिनके न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रिया पर प्रभाव साहित्य में स्थापित होते हैं। परिणाम साहित्य के अनुरूप थे और आइसोफॉर्म-विशिष्ट आरएआर मॉड्यूलेशन के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क व्यवहार के आगे लक्षण वर्णन की अनुमति दी।
इस नई पद्धति ने पूरे-न्यूरॉन माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क के तेजी से और मान्य लक्षण वर्णन की अनुमति दी, लेकिन यह अक्षतंतु और सेल बॉडी माइटोकॉन्ड्रिया के बीच भेदभाव की भी अनुमति देता है, जो तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र में लागू करने के लिए एक आवश्यक विशेषता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल तेजी से अभिनय उपचार का उपयोग कर प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है, उपचार से पहले और बाद में एक ही कोशिकाओं की इमेजिंग की अनुमति देता है, तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र को पार.
Introduction
सेलुलर माइटोकॉन्ड्रिया सभी शारीरिक राज्यों के केंद्र में बैठते हैं, और उनके होमोस्टैसिस (माइटोस्टेसिस) और व्यवहार की पूरी तरह से समझ कैंसर और अल्जाइमर रोग 1,2 सहित बीमारियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए औषधीय उपचार की पहचान करने में सहायता करने के लिए सर्वोपरि है।
माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा होमियोस्टेसिस, एटीपी पीढ़ी, कैल्शियम बफरिंग और आरओएस विनियमन में महत्वपूर्ण सेलुलर भूमिका निभाते हैं, और प्रोटीन होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए माइटोस्टेसिस आवश्यक है क्योंकि आणविक चैपरोन ऊर्जा-निर्भर हैं3. इन्हें सेलुलर जरूरतों को कुशलतापूर्वक पूरा करने के लिए एक निरंतर और गतिशील नेटवर्क मॉड्यूलेशन और अनुकूलन की आवश्यकता होती है, और माइटोकॉन्ड्रिया परिवहन को विभिन्न सिग्नलिंग मार्गों द्वारा नियंत्रित किया जाता है; पिछले काम रेटिनोइक एसिड रिसेप्टर्स (आरएआर)4,5की है कि एक तरह के मार्ग का वर्णन किया है. रेटिनोइक एसिड (आरए) आरएआर सक्रियण के माध्यम से एक्सोनल और न्यूराइट आउटग्रोथ को बढ़ावा देता है। माउस प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स में, आरएआर -β की सक्रियता न्यूराइट6 में माइटोकॉन्ड्रियल विकास, गति और गतिशीलता को प्रोत्साहित करती है।
माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क अनुकूलनशीलता और गतिशीलता को ध्यान में रखते हुए, “वास्तविक समय” में माइटोस्टेसिस का आकलन करने की संभावना न केवल ऊर्जा होमियोस्टेसिस की जांच के लिए आवश्यक है, बल्कि प्रोटियोस्टेसिस, सेलुलर स्वास्थ्य, प्रसार या सिग्नलिंग के लिए भी आवश्यक है। माइटोस्टेसिस के मूल्यांकन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि फ्लोरोसेंट डाई या मार्कर का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रिया को उजागर करने के बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर निर्भर करती है, साथ ही तापमान और / या सीओ2 विनियमन7 की अनुमति देने वाला एक विशिष्ट माइक्रोस्कोपी सेटअप। प्रयोगात्मक सेटअप के इस प्रकार पर जोर देता है कि एक प्रयोगात्मक प्रतिकृति एक समय में प्रदर्शन किया जा. विभिन्न उपचारों की प्रयोगात्मक पुनरावृत्ति के अलावा, यह माना जाना चाहिए कि अधिकांश प्रयोगों में उनकी तकनीकी प्रतिकृतियां होनी चाहिए (जहां प्रति प्लेट एक से अधिक स्थिति की कल्पना की जाती है), फोकल विमानों (जेड-स्टैक) की एक श्रृंखला के साथ समय बिंदुओं की एक श्रृंखला में दर्ज किया जा रहा है। इस प्रकार, एक नियंत्रण और दो उपचार के तीन पुनरावृत्ति के साथ एक प्रयोगात्मक डिजाइन, प्लेट प्रति पांच इमेजिंग पदों और 15 समय अंक के साथ, 225 ढेर में संसाधित किया जा करने के लिए परिणाम. शास्त्रीय रूप से, लाइव माइटोकॉन्ड्रिया के वीडियो का विश्लेषण काइमोग्राफ की साजिश रचकर किया गया था, जिसे व्यक्तिगत रूप से8 का विश्लेषण किया जाएगा, एक समय लेने वाली प्रक्रिया में व्यापक मैनुअल इनपुट की आवश्यकता होती है, यहां तक कि कंप्यूटर टूल पर भरोसा करते समय भी।
एक एल्गोरिथ्म हाल ही में9 कि स्वचालित विभाजन और लाइव सेल 2 डी और 3 डी समय चूक फ़ाइलों में माइटोकॉन्ड्रिया की ट्रैकिंग की अनुमति देता है वर्णित किया गया था. अन्य परिमाणीकरण तकनीक उपलब्ध हैं, और सभी की अपनी सीमाएंहैं 10. माइटोमीटर, एक स्वचालित ओपन-सोर्स एप्लिकेशन, विशेष रूप से समय चूक और माइटोकॉन्ड्रिया गतिशीलता विश्लेषण के लिए पर्याप्त है, जिसके लिए कम उपयोगकर्ता इनपुट की आवश्यकता होती है। इस एप्लिकेशन में अन्य मौजूदा MATLAB- आधारित उपकरणों पर फायदे की एक श्रृंखला है, अर्थात् व्यक्तिगत TIF स्टैक के स्वचालित प्रसंस्करण की अनुमति देना, 13 अलग-अलग मापदंडों का उपयोग करना, विशेष रूप से तंत्रिका विज्ञान के लिए दिलचस्प है, क्योंकि यह पेरी- और टेली-न्यूक्लियर माइटोकॉन्ड्रिया के बीच अंतर करता है।
हालांकि, ऊपर वर्णित जैसे प्रयोग के लिए, 225 स्टैक पर लागू इन 13 मापदंडों के परिणामस्वरूप 2,925 व्यक्तिगत आउटपुट फाइलें होती हैं। इनके लिए चार अलग-अलग कंप्यूटर इनपुट की आवश्यकता होती है, जो सभी आउटपुट फ़ाइलों को डाउनलोड करने के लिए आवश्यक 10,000 से अधिक मैनुअल इनपुट तक होते हैं। बड़े प्रयोगात्मक डिजाइनों के लिए, इसके परिणामस्वरूप प्रत्येक फ़ाइल और डेटा एकीकरण का अनावश्यक रूप से अत्यधिक समय लेने वाला विश्लेषण होता है। यहां हम एक नियमित अनुकूलन प्रस्तुत करते हैं जो तेजी से फ़ाइल विश्लेषण की अनुमति देता है, दस्तावेज़ पढ़ने और डेटा प्रोसेसिंग को बहुत कम करता है, परिभाषित तरीके से डेटा का विश्लेषण करता है, मौजूदा उपकरणों से आउटपुट के अनुरूप है।
Protocol
Representative Results
Discussion
लाइव सेल इमेजिंग बड़ी फ़ाइलों का उत्पादन करती है जिन्हें गंभीर कंप्यूटिंग प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है, लेकिन यहां तक कि सबसे हाल के उपकरणों को संसाधित करने के लिए व्यापक मैनुअल इनपुट की आवश्यकता ह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
छवि अधिग्रहण iBiMED की LiM सुविधा में किया गया था, PPBI (बायोइमेजिंग का पुर्तगाली प्लेटफ़ॉर्म): POCI-01-0145-FEDER-022122 का एक नोड। इस काम को FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276) द्वारा समर्थित किया गया था, Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND) से DT को अनुदान, ATG-The Gabba Alumni Association से VP को अनुदान, और इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिसिन-iBiMED, यूनिवर्सिटी ऑफ एवेइरो।
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Riferimenti
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