Optimalisert automatisert analyse av levende neuronale mitokondrier Homeostasemodulasjon av isoform-spesifikke retinsyrereseptorer
Summary
Det mitokondrielle nettverket er ekstremt komplekst, noe som gjør det svært utfordrende å analysere. Et nytt MATLAB-verktøy analyserer levende konfokale avbildede mitokondrier i timelapse-bilder, men resulterer i et stort utgangsvolum som krever individuell manuell oppmerksomhet. For å løse dette problemet ble det utviklet en rutinemessig optimalisering som muliggjorde rask filanalyse.
Abstract
Det komplekse mitokondrielle nettverket gjør det svært utfordrende å segmentere, følge og analysere levende celler. MATLAB-verktøy gjør det mulig å analysere mitokondrier i timelapse-filer, noe som forenkler og fremskynder prosessen med bildebehandling betydelig. Ikke desto mindre produserer eksisterende verktøy et stort utskriftsvolum som krever individuell manuell oppmerksomhet, og grunnleggende eksperimentelle oppsett har tusenvis av filer, som hver krever omfattende og tidkrevende håndtering.
For å løse disse problemene ble det utviklet en rutineoptimalisering, både i MATLAB-kode og live-script-skjemaer, noe som muliggjorde rask filanalyse og betydelig reduksjon av dokumentlesing og databehandling. Med en hastighet på 100 filer/min tillater optimaliseringen en samlet rask analyse. Optimaliseringen oppnår resultatene ved å beregne gjennomsnitt av rammespesifikke data for individuelle mitokondrier gjennom tidsrammer, analysere data på en definert måte, i samsvar med de som sendes ut fra eksisterende verktøy. Levende konfokal avbildning ble utført ved bruk av fargestofftetrametylrhodaminmetylesteren, og rutineoptimaliseringen ble validert ved å behandle nevronceller med retinsyrereseptoragonister, hvis effekter på nevronale mitokondrier er etablert i litteraturen. Resultatene var i samsvar med litteraturen og tillot ytterligere karakterisering av mitokondrienettverksadferd som respons på isoformspesifikk RAR-modulering.
Denne nye metoden tillot rask og validert karakterisering av hele neuron mitokondrier nettverk, men det tillater også differensiering mellom axon og cellelegeme mitokondrier, en viktig funksjon å anvende i nevrovitenskapsfeltet. Videre kan denne protokollen brukes på eksperimenter ved hjelp av hurtigvirkende behandlinger, slik at avbildning av de samme cellene før og etter behandlinger, overskrider nevrovitenskapsområdet.
Introduction
Cellulære mitokondrier sitter i sentrum av alle fysiologiske tilstander, og en grundig forståelse av deres homeostase (mitostase) og oppførsel er avgjørende for å hjelpe til med å identifisere farmakologisk behandling for et bredt spekter av sykdommer, inkludert kreft og Alzheimers sykdom 1,2.
Mitokondrier spiller avgjørende cellulære roller i energihomeostase, ATP-generering, kalsiumbuffering og ROS-regulering, og mitostase er avgjørende for å opprettholde proteinhomeostase, da molekylære chaperoner er energiavhengige3. Disse krever en konstant og dynamisk nettverksmodulasjon og tilpasning for effektivt å møte cellulære behov, og mitokondrietransport reguleres av forskjellige signalveier; Tidligere arbeid har beskrevet en slik vei, den for retinsyrereseptorer (RARs)4,5. Retinsyre (RA) fremmer aksonal og nevrittutvekst via RAR-aktivering. I primære kortikale nevroner fra mus oppmuntrer aktivering av RAR-β mitokondriell vekst, hastighet og mobilitet i nevitt6.
Med tanke på mitokondrienettverkets tilpasningsevne og dynamikk, er muligheten for å vurdere mitostase i “sanntid” viktig, ikke bare for å undersøke energihomeostase, men også for proteostase, cellulær helse, spredning eller signalering. En vanlig metode for evaluering av mitostase er avhengig av konfokalmikroskopi etter å ha fremhevet mitokondrier ved hjelp av et fluorescerende fargestoff eller markør, samt et spesifikt mikroskopioppsett som tillater temperatur og / eller CO2 -regulering7. Denne typen eksperimentelt oppsett innebærer at en eksperimentell replikasjon utføres om gangen. I tillegg til eksperimentell repetisjon av forskjellige behandlinger, bør det tas i betraktning at de fleste eksperimenter bør ha sine tekniske replikater (hvor mer enn én posisjon er avbildet per plate), med en serie fokalplan (z-stabler) som registreres i en rekke tidspunkter. Dermed resulterer et eksperimentelt design med tre repetisjoner av en kontroll og to behandlinger, med fem avbildningsposisjoner per plate og 15 tidspunkter, i 225 stabler som skal behandles. Klassisk ble videoer av levende mitokondrier analysert ved å plotte kymographs, som ville bli individuelt analysert8, i en tidkrevende prosess som krever omfattende manuell inngang, selv når man stoler på dataverktøy.
En algoritme ble nylig beskrevet9 som tillater automatisert segmentering og sporing av mitokondrier i live-celle 2-D og 3-D time-lapse-filer. Andre kvantifiseringsteknikker er tilgjengelige, og alle har sine begrensninger10. Mitometer, en automatisert åpen kildekode-applikasjon, er spesielt tilstrekkelig for tidsforløp og mitokondriedynamikkanalyse, og krever lav brukerinngang. Denne applikasjonen har en rekke fordeler i forhold til andre eksisterende MATLAB-baserte verktøy, nemlig å tillate automatisk behandling av individuelle TIF-stabler, ved hjelp av opptil 13 forskjellige parametere, spesielt interessant for nevrovitenskap, da det skiller mellom peri- og telenukleære mitokondrier.
Men for et eksperiment som beskrevet ovenfor, resulterer disse 13 parametrene som brukes på 225 stabler i 2,925 individuelle utdatafiler. Disse krever fire individuelle datamaskininnganger, som summerer opp til over 10.000 manuelle innganger som kreves for å laste ned alle utdatafiler. For store eksperimentelle design resulterer dette i en unødvendig ekstremt tidkrevende analyse av hver fil og dataintegrasjon. Her presenterer vi en rutinemessig optimalisering som muliggjør rask filanalyse, reduserer dokumentlesing og databehandling, analyserer data på en definert måte, i samsvar med utdataene fra eksisterende verktøy.
Protocol
Representative Results
Discussion
Live cell imaging produserer store filer som krever seriøs databehandling, men selv de nyeste verktøyene krever omfattende manuell input for å behandle. Denne rutinemessige optimaliseringen er fokusert på å forenkle prosessen med mitokondrieanalyse på Mitometer fordi dette verktøyet gir en veldig god balanse mellom brukerinngang og datautgang. En omfattende sammenligning mellom ulike verktøy for mitokondriebildeanalyse er tidligere gjennomgått10. Mens andre rørledninger er mer fokusert p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bildeinnsamling ble utført i LiM-anlegget til iBiMED, en node av PPBI (portugisisk plattform for BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122. Dette arbeidet ble støttet av FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276), et tilskudd til DT fra Fundação para a Ciência e Tecnologia fra Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), et stipend fra ATG-The Gabba Alumni Association til VP, og Institute for Biomedicine-iBiMED, University of Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Riferimenti
- Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
- Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
- Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
- Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
- Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
- Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
- Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754 (2013).
- Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
- Chu, C. -. H., Tseng, W. -. W., Hsu, C. -. M., Wei, A. -. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775 (2022).
- Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
- Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628 (2021).
- Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).
