Påvisande av rabies-, IgG- och IgM-antikroppar med hjälp av det indirekta fluorescerande rabiesantikroppstestet
Summary
Syftet med detta manuskript är att undersöka användningen av rabies indirekt fluorescerande antikroppstest för detektion av rabiesspecifika IgG- och IgM-antikroppar.
Abstract
Testet för indirekt fluorescerande rabiesantikroppar (IFA) utvecklades för att påvisa olika rabiesspecifika antikroppsisotyper i serum eller ryggmärgsvätska. Detta test ger snabba resultat och kan användas för att påvisa rabiesantikroppar i flera olika scenarier. IFA-testet för rabies är särskilt användbart för snabb och tidig upptäckt av antikroppar för att utvärdera immunsvaret hos en patient som har utvecklat rabies. Även om andra metoder för diagnos av rabies före döden har företräde, kan detta test användas för att påvisa nyligen exponering för rabiesvirus genom antikroppsdetektion. IFA-testet ger inte en virusneutraliserande antikroppstiter (VNA), men preexpositionsprofylaxsvaret (PrEP) kan utvärderas genom positiv eller negativ antikroppsnärvaro. Detta test kan användas i olika situationer och kan ge resultat för ett antal olika mål. I den här studien använde vi flera parade serumprover från individer som fick PrEP och visade deras förekomst av rabiesantikroppar över tid med hjälp av IFA-testet.
Introduction
Indirekt fluorescerande rabiesantikroppstest (IFA) används för att påvisa olika rabiesspecifika antikroppsisotyper i serum eller ryggmärgsvätska. Det är ett av en arsenal av tester som finns tillgängliga för att övervaka en rabiespatient före döden. Det är särskilt användbart för tidig upptäckt av antikroppar för att utvärdera en patients immunsvar mot rabiesinfektion. När IFA-testet används tillsammans med andra tester, fallhistoria och patientens vaccinationsstatus kan det hjälpa till att fastställa exponeringen för rabiesvirus eller ett vaccin1. Eftersom IFA-testet mäter IgM och/eller IgG kan värdena för den specifika antikroppen indikera en ungefärlig tidsram från exponering för antigen1. Detta test kan vara användbart i de listade applikationerna eller andra som ännu inte utforskats.
Det finns flera serologiska analyser av rabies. RFFIT (Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test) och FAVN-test (fluorescent antibody virus neutralization) eller modifieringar av dessa är de primära metoderna för att mäta rabiesvirusneutraliserande antikroppar (RVNA)1. Dessa tester skiljer dock inte mellan IgM- och IgG-antikroppar. När det är viktigt att differentiera antikroppsisotypen för att övervaka rabiesimmunsvaret används rabies IFA- och ELISA-tester (rabies enzyme-linked immunosorbent assay), men de mäter inte RVNA. Även om IFA- och ELISA-testerna kan användas för att fastställa förekomsten av rabiesspecifika antikroppar i ett prov, finns det vissa skillnader i hur de utförs. IFA-testet använder ett cellodlat levande virus som antigensubstrat, medan ett typiskt ELISA för rabiesdetektion använder ett eller flera av virusproteinerna. I laboratoriemiljö där rabiesviruset kan odlas kan det vara lättare att utföra IFA-testet i stället för att köpa eller odla enskilda virusproteiner för ELISA. Syftet med testningen och den information som erhålls från resultaten av en serologisk rabiesanalys bör beaktas när man bestämmer vilken som ska väljas2.
IgM är den första som svarar och ökar tills klassbyte observeras runt dag 28, då IgG blir den dominerande cirkulerande antikroppen3. IgM kan därför endast förväntas under en begränsad tid efter exponering för rabiesvirus eller vaccination. Testning av både serum och cerebrospinalvätska (CSF) kan indikera om exponeringen skedde genom vaccination, där antikroppar endast skulle ses i serum, eller från en virusinfektion, som potentiellt skulle visa antikroppar i CSF1.
Det har fastställts att rabiesantikroppar kvarstår i flera år efter preexpositionsprofylax (PrEP)4. IFA-testet kan vara ett användbart verktyg för att visa detta vid olika tidpunkter efter vaccination eller exponering.
Protocol
Representative Results
Discussion
IFA-testet drar nytta av ett antigen-antikroppskomplex, vilket gör det möjligt för en märkningsplats att visualisera rabiesspecifika antikroppar. Neuroblastom- eller BHK-celler sås på PTFE-belagda mikroskopglas med flera brunnar och inokuleras med rabiesviruslaboratoriestammen CVS-11. När monolagret är sammanflytande och cellerna når den önskade infektionsförmågan på cirka 50 % lagras objektglasen tills de är klara för användning6.
Patientserum eller cer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot New York State Department of Health Wadsworth Center för att de stöder detta projekt.
Materials
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well Teflon coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500 or 6500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
Riferimenti
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. . Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).
