Enkelt-kopi gen locus kromatin oprensning i Saccharomyces cerevisiae
Summary
Denne protokol præsenterer en locus-specifik kromatinisoleringsmetode baseret på stedspecifik rekombination for at rense et enkeltkopi-gensted af interesse i dets oprindelige kromatinkontekst fra spirende gær, Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Den grundlæggende organisatoriske enhed af eukaryot kromatin er nukleosomkernepartiklen (NCP), som omfatter DNA indpakket ~ 1,7 gange omkring en histonoctammer. Kromatin defineres som enheden af NCP’er og adskillige andre proteinkomplekser, herunder transkriptionsfaktorer, kromatinremodellering og modificerende enzymer. Det er stadig uklart, hvordan disse protein-DNA-interaktioner orkestreres på niveauet af specifikke genomiske loci under forskellige stadier af cellecyklussen. Dette skyldes hovedsageligt de nuværende tekniske begrænsninger, som gør det udfordrende at opnå præcise målinger af sådanne dynamiske interaktioner. Her beskriver vi en forbedret metode, der kombinerer stedspecifik rekombination med en effektiv enkelttrins affinitetsrensningsprotokol for at isolere et enkeltkopi-gen-locus af interesse i dets oprindelige kromatintilstand. Metoden muliggør robust berigelse af målstedet over genomisk kromatin, hvilket gør denne teknik til en effektiv strategi til identifikation og kvantificering af proteininteraktioner på en upartisk og systematisk måde, for eksempel ved massespektrometri. Ud over sådanne sammensætningsanalyser afspejler naturligt chromatin renset ved denne metode sandsynligvis in vivo-situationen med hensyn til nukleosompositionering og histonmodifikationer og kan derfor underkastes yderligere strukturelle og biokemiske analyser af kromatin afledt af praktisk talt ethvert genomisk locus i gær.
Introduction
Den dynamiske organisering af eukaryote genomer i kromatin komprimerer DNA’et, så det passer inden for kernens grænser, samtidig med at der sikres tilstrækkelig dynamik til genekspression og tilgængelighed for regulatoriske faktorer. Til dels medieres denne alsidighed af nukleosomet, den grundlæggende enhed af kromatin, som omfatter en kernepartikel med 147 bp DNA indpakket ~ 1,7 gange omkring histonoctammeren1. Nukleosomet er en meget dynamisk struktur med hensyn til dets sammensætning med adskillige histonvarianter og posttranslationelle modifikationer (PTM’er) på de N- og C-terminale histonhaler. Desuden interagerer eukaryot kromatin med en lang række andre væsentlige komponenter, såsom transkriptionsfaktorer, DNA- og RNA-behandlingsmaskiner, arkitektoniske proteiner, enzymer involveret i kromatinremodellering og modifikation og RNA-molekyler forbundet med kromatin. Disse vigtige maskiner, der er involveret i transkription, replikation og reparation, kræver alle adgang til kromatin, som fungerer som det naturlige substrat for disse processer. Følgelig kræver forståelsen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for disse DNA-transaktioner, en præcis definition af de kollektive ændringer i kromatinstrukturen i de specifikke genomiske regioner, hvor disse maskiner konvergerer og letter biologiske reaktioner.
På trods af identifikation af adskillige kromatinfaktorer gennem genetik og protein-protein-interaktionsundersøgelser er udførelse af direkte, upartiske og omfattende analyser af kromatininteraktioner på bestemte genomiske steder forblevet en betydelig hindring 2,3. Indledningsvis kunne kun meget rigelige områder af genomet (dvs. gentagne loci) eller multikopiplasmider isoleres i tilstrækkelige mængder og renhed til massespektrometrisk identifikation af de associerede proteiner 4,5,6,7. En række nye tilgange baseret på direkte hybridisering af indfangningssonder til kromatiniseret DNA, nærhedsbiotinylering ved hjælp af CRISPR-dCas9-systemet eller binding af sekvensspecifikke adapterproteiner til det interessante sted er begyndt at optrævle proteomet af enkeltkopi-loci fra gær- og pattedyrgenomer 8,9,10. Imidlertid kræver alle disse metoder formaldehydtværbinding for at stabilisere protein-DNA-interaktionerne og sonikering for at opløse kromatinet til efterfølgende oprensning. Sammen udelukker begge manipulationer muligheden for efterfølgende strukturelle og funktionelle undersøgelser af det rensede kromatin.
For at overvinde disse begrænsninger har vi tidligere udtænkt en metode, der anvender stedspecifik rekombination til at udtrække målrettede kromosomale domæner fra gær 11,12. I det væsentlige er det genomiske område af interesse omgivet af genkendelsessteder (RS) for den stedspecifikke R-rekombinase fra Zygosaccharomyces rouxi, samtidig med at den inkorporerer en gruppe af tre DNA-bindingssteder for det prokaryote transkriptionelle repressor LexA-protein (LexA) inden for samme region. Gærcellerne indeholder en ekspressionskassette til samtidig ekspression af R-rekombinase og et LexA-protein smeltet sammen med et tandemaffinitetsrensningsmærke (TAP). Efter induktionen af R-rekombinase udskærer enzymet effektivt målområdet fra kromosomet i form af et cirkulært kromatindomæne. Dette domæne kan renses via LexA-TAP-adapterproteinet, som binder til LexA DNA-bindingsstederne såvel som til en affinitetsstøtte. Denne metode er for nylig blevet brugt til at isolere forskellige kromatindomæner, der indeholder udvalgte replikationsoprindelser af gærkromosom III13.
En stor fordel ved denne ex vivo-tilgang er, at den giver mulighed for funktionelle analyser af det isolerede materiale. For eksempel kan replikationsoprindelsesdomæner, der er renset med denne metode, underkastes di vitro-replikationsassays for at vurdere effektiviteten af oprindelsesaffyring i et reagensglas fra native in vivo-samlede kromatinskabeloner. I sidste ende kan den biokemiske og funktionelle karakterisering af det isolerede materiale tillade rekonstitution af nukleare processer ved anvendelse af rensede proteiner sammen med den oprindelige kromatinskabelon. Sammenfattende åbner denne metode en spændende vej inden for kromatinforskning, da det vil være muligt at følge de kollektive sammensætnings- og strukturelle kromatinændringer i en bestemt genomisk region, der gennemgår en bestemt kromosomtransaktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identificeringen af faktorer og kromatinlandskab i en specifik målgenomregion udgør fortsat en stor udfordring inden for kromatinforskning18. Denne protokol beskriver et effektivt system til specifikt at punktafgifter og rense forskellige kromatindomæner fra gærkromosomer. Så vidt vi ved, overvinder renheden og udbyttet af denne enkelttrinsoprensning mange af begrænsningerne ved locusspecifikke kromatinrensningsmetoder, hvilket muliggør opnåelse af meget høj berigelse af de målrettede lo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet i S.H.-laboratoriet blev støttet af DFG gennem SFB1064 (projekt-ID 213249687), Det Europæiske Forskningsråd (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) og Helmholtz Gesellschaft.
Materials
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
Riferimenti
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
- Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
- Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
- Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
- Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
- Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
- Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
- Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
- Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
- Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
- Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023)
- Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).
