成像平台“The Lifespan Machine”可自动对大量人群进行终生观察。我们展示了进行寿命、抗逆性、发病机制和行为衰老测定所需的步骤。数据的质量和范围使研究人员能够研究衰老干预措施,尽管存在生物和环境差异。
在恒定环境中饲养的基因相同的动物显示出广泛的寿命分布,反映了所有研究的生物体中保守的衰老的巨大非遗传,随机方面。这种随机成分意味着,为了了解衰老并确定延长寿命或改善健康的成功干预措施,研究人员必须同时监测大量实验动物。传统的手动死亡评分限制了大规模假设检验所需的通量和规模,从而开发了用于高通量寿命测定的自动化方法。Lifespan Machine (LSM) 是一个高通量成像平台,它将改进的平板扫描仪与定制的图像处理和数据验证软件相结合,用于线虫的终身跟踪。该平台以前所未有的规模,以与经验丰富的研究人员进行的手动分析相当的统计精度和准确性,从大量动物种群中生成高度时间分辨率的寿命数据,这是一项重大的技术进步。最近,LSM得到了进一步发展,以量化衰老过程中观察到的行为和形态变化,并将其与寿命联系起来。在这里,我们将介绍如何使用 LSM 计划、运行和分析自动化生命周期实验。我们进一步强调了成功收集行为数据和高质量生存曲线所需的关键步骤。
衰老是一个复杂的、多方面的过程,其特征是生物体的生理功能下降,随着时间的推移,导致疾病和死亡的风险增加1.寿命,以从出生或成年开始到死亡的时间来衡量,提供了衰老的明确结果2 ,并为衡量人口之间的相对衰老速度提供了一个间接但严格的定量代理3。衰老研究通常依赖于对寿命的准确测量,类似于临床试验,以比较暴露于干预的人群和未暴露的对照组之间的结果。不幸的是,可重复性问题充斥着老化研究,有时是由于统计学上功效不足的实验4 ,通常是因为寿命测定对环境细微变化的固有敏感性5。稳健的实验需要对大量群体进行多次重复,而这一过程尤其受益于自动化6 提供的实验可扩展性。
寿命测定的严格要求源于老化过程本身的不可预测性。居住在相同环境中的同基因个体表现出不同的死亡时间和生理衰退率7,这表明寿命涉及高度的随机性7,8。因此,需要大量人口来衡量衰老过程中的定量变化,例如平均或最长寿命的变化,并克服因个体变异而产生的偏差。此外,高通量寿命测定的能力对于支持生存曲线形状和衰老动态模型的研究至关重要9.
线虫秀丽隐杆线虫因其寿命短、遗传可处理性和快速生成时间而成为衰老研究的宝贵模型,这突显了其适用于高通量衰老和寿命测定。传统上,C.线虫的测量方法是在固体培养基上跟踪大约50-100只动物的同步小种群,并记下个体死亡的时间。随着动物年龄的增长和行动能力的丧失,手动计算死亡时间需要单独刺激动物并检查头部或尾巴的微小运动。这通常是一个繁琐而费力的过程,尽管已经努力加速它10,11,12。重要的是,缓慢的实验管道阻碍了我们对衰老的理解和经过测试的干预措施的有效性的进展。
为了满足老化研究对定量数据的需求,已经开发了许多用于自动化数据收集的技术,包括从微流控室到平板扫描仪的一系列方法13,14,15,16,17,18。LSM 与其他方法的不同之处在于,它对收集高精度和准确的寿命数据进行了广泛的优化,这是通过开发仔细的设备校准协议和广泛的软件套件来实现的,该软件套件允许用户验证、校正和完善自动分析13。虽然该软件原则上可以应用于不同的成像模式,但在实践中,大多数用户使用经过修改的平板扫描仪,以便对环境温度和湿度进行微调控制,这些因素因其对寿命的重大影响而至关重要19。LSM 每 20 分钟拍摄一次线虫图像,间隔从几天到几个月不等,具体取决于环境条件和基因型。与手动测定的数据相比,产生的数据具有更高的时间分辨率,并且收集的图像提供了线虫在整个生命周期中位置的永久视觉记录。使用机器学习方法,死亡时间会自动分配给每个人。这些结果可以使用称为“蠕虫浏览器”的客户端软件快速手动验证。由于其硬件和软件,LSM 可以生成生存曲线,这些曲线在统计学上与经验丰富的研究人员手中的手动死亡评分没有区别,具有减少工作量和提高可扩展性的额外优势13。
最新版本的LSM还允许通过收集线虫一生中的形态和行为数据以及每个人的寿命来研究行为衰老。特别是,LSM捕捉了每只动物剧烈运动停止(VMC)的时间,这是一个里程碑,通常用于量化个体的“健康寿命”,而不是其寿命。通过同时收集寿命和行为衰老数据,LSM 支持研究可能对20 岁衰老的不同表型结果产生不同影响的干预措施。各种宏观上可观察到的表型可用于研究行为衰老,例如身体运动或咽部泵送21、组织完整性22 以及运动速度或刺激诱导的转弯17。不同衰老表型之间的比较可以支持对衰老过程因果结构的分析。例如,VMC和寿命之间的比较最近被用来表征秀丽隐杆线虫的两种不同的衰老过程23。
虽然最初是为了测量秀丽隐杆线虫的寿命而开发的,但LSM支持从一系列线虫物种(包括C)收集生存和行为数据。布里格萨,C.热带,C.粳稻,C.brenneri 和 P.太平洋23.该技术有助于研究生物和环境干预对寿命、抗逆性和病原体抗性的影响,并且可以与实验工具相结合,例如RNA干扰的靶向测定或生长素诱导的蛋白质降解系统。迄今为止,它已在科学文献中广泛用于6,24,25,26,27,28,29,30的广泛应用。
在这里,我们概述了使用琼脂平板进行Lifespan Machine实验的分步方案,从实验设置的初始阶段到结果生存曲线的输出。LSM的一个显着特点是这项工作是高度前置的,这意味着研究人员的大部分时间都花在实验设置上,在很小的程度上,花在图像采集后。在整个实验过程中,数据收集是完全自动化的,使研究人员能够获得“免提”体验。这里描述的步骤在许多不同类型的生存测定中是通用的 – 对寿命、耐热性、氧化应激和发病机制测定执行相同的实验设置。在代表性结果部分,我们讨论了最近发表的手稿中的数据子集,以说明分析管道的有效性,并强调图像分析过程中最重要的步骤23。
在这里,我们提供了一个详细的、可访问的协议,用于使用最新版本的 Lifespan Machine 执行实验。我们已经证明,实现良好分辨率的生存曲线的关键步骤是在图像采集后手动排除非蠕虫物体。手动死亡时间注释对生存曲线的整体形状影响很小,这表明即使没有手动注释,全自动死亡时间估计也是有效的(图8)。相反,获取高质量的行为衰老数据需要更仔细地注释死亡时间,尤…
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Julian Ceron 和 Jeremy Vicencio (IDIBELL Barcelona) 产生 rpb-2(cer135) 等位基因。该项目由欧洲研究委员会 (ERC) 根据欧盟地平线 2020 研究和创新计划(赠款协议第 852201 号)、西班牙经济、工业和竞争力部 (MEIC) 资助 EMBL 合作伙伴关系、Centro de Excelencia Severo Ochoa (CEX2020-001049-S, MCIN/AEI /10.13039/501100011033)、CERCA 计划/加泰罗尼亚将军、MEIC Excelencia 奖 BFU2017-88615-P, 以及格伦医学研究基金会颁发的奖项。
1-Naphtaleneacetic acid (Auxin) | Sigma | N0640 | Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar |
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR) | Sigma | F0503 | 27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria |
Glass cleaner | Kristal-M | QB-KRISTAL-M125ml | |
Hydrophobic anti-fog glass treatment | Rain-X Scheibenreiniger | C. 059140 | |
Rubber matt | Local crafstman | Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock | |
Scanner glass | Local hardware supplier | 9" x 11.5" inch glass sheet | |
Scanner plates | Life Sciences | 351006 | 50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish |
USB Reference Thermometer | USB Brando | ULIFE055500 | For calibrating temperature of scanners |