כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקת כתב מבוססת לוציפראז בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.
עדויות הולכות וגדלות הראו כי שטף אוטופגי גבוה קשור להתקדמות הגידול ולעמידות לטיפול בסרטן. בדיקת חלבוני אוטופגיה בודדים היא תנאי מוקדם לאסטרטגיות טיפוליות המכוונות למסלול זה. עיכוב של פרוטאז אוטופגיה ATG4B הוכח כמגביר את ההישרדות הכוללת, דבר המצביע על כך ש- ATG4B יכול להיות מטרה פוטנציאלית לטיפול בסרטן. המעבדה שלנו פיתחה בדיקה סלקטיבית מבוססת לוציפראז לניטור פעילות ATG4B בתאים. עבור בדיקה זו, המצע של ATG4B, LC3B, מתויג במסוף C עם לוציפראז סודי מהקופפוד הימי Gaussia princeps (GLUC). כתב זה מקושר לשלד הציטופלזמה של האקטין ובכך שומר אותו בציטופלסמה של תאים כאשר הוא משוחרר. מחשוף בתיווך ATG4B גורם לשחרור GLUC על ידי הפרשה לא קונבנציונלית, אשר לאחר מכן ניתן לנטר על ידי קצירת supernatants מתרבית תאים כמתאם של פעילות ATG4B תאית. מאמר זה מציג את ההתאמה של בדיקה מבוססת לוציפראז זו לסינון אוטומטי בתפוקה גבוהה. אנו מתארים את זרימת העבודה והאופטימיזציה לניתוח מופתי של תפוקה גבוהה של פעילות ATG4B סלולרית.
אוטופגיה היא תהליך מטבולי שמור המאפשר לתאים לשמור על הומאוסטזיס תוך-תאי ולהגיב ללחץ על ידי פירוק תוכן תאי מיושן, פגום או מיותר באמצעות ליזוזומים 1,2,3. בתנאים פתופיזיולוגיים מסוימים, תהליך זה פועל כתגובה תאית חיונית למחסור בחומרים מזינים ובחמצן, וכתוצאה מכך חומרים מזינים ושומנים ממוחזרים, המאפשרים לתאים להסתגל לצרכים המטבוליים שלהם 2,3,4. אוטופגיה זוהתה גם כתגובת עקה תאית הקשורה למספר מחלות, כגון הפרעות נוירודגנרטיביות, זיהום פתוגן וסוגים שונים של סרטן. תפקידה של אוטופגיה בסרטן מורכב ותלוי בסוג, בשלב ובסטטוס של הגידול. זה יכול לדכא גידולים באמצעות פירוק אוטופגי של תאים פגומים, אבל יכול גם לקדם את ההישרדות של גידולים מתקדמים על ידי שיפור הישרדות התאים במהלך תנאי עקה, כגון היפוקסיה, חסך תזונתי, נזק ציטוטוקסי 2,4,5,6.
מספר מחקרים הראו כי עיכוב אוטופגיה מספק יתרון כאסטרטגיה נגד סרטן. לפיכך, עיכוב של צעדים קריטיים, כגון היווצרות אוטופגוזום או איחוי שלה עם הליזוזום, יכול להיות שיטה יעילה לשליטה בסרטן 2,4,5,6. עדויות הולכות וגדלות הראו כי ATG4B מעורב במצבים פתולוגיים מסוימים, והוא זכה לתשומת לב כיעד פוטנציאלי נגד סרטן 2,3,4. לדוגמה, נצפה כי תאי סרטן המעי הגס והחלחולת וקולטן גורם גדילה אפידרמיס אנושי 2 (HER2) חיובי לתאי סרטן השד היו בעלי רמות ביטוי ATG4B גבוהות משמעותית מאשר תאים נורמליים סמוכים 2,4. בתאי סרטן הערמונית, עיכוב ATG4B הביא לרגישות ספציפית לקו תאים לכימותרפיה והקרנות7. לאחרונה, התגלו ראיות חזקות לכך שאדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) פגיעה במיוחד לעיכוב ATG4B. לדוגמה, במודל עכבר מהונדס גנטית, הוכח כי אובדן לסירוגין של תפקוד ATG4B מפחית את צמיחת הגידול PDAC ומגביר את הישרדות 3,4. בסך הכל, ATG4B מתבטא יתר על המידה בכמה סוגי סרטן, קשור להתקדמות הגידול, והוא קשור לעמידות לטיפול בסרטן 2,4,8.
לפרוטאזות ציסטאין ATG4 ביונקים יש ארבעה בני משפחה, ATG4A-ATG4D. חלבונים אלה מפגינים סלקטיביות מטרה מסוימת כלפי משפחת החלבוניםLC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 וייתכן שיש להם תפקידים נוספים שאינם קשורים לפעילות הפרוטאז שלהם 12,13. יתר על כן, ATG4 מתפקד בוויסות סוג חדש של שינוי לאחר תרגום, ATG8-ylation של חלבונים11,12. בעוד ATG4B והמצע העיקרי שלו LC3B הם הנחקרים ביותר, מתגבשת תמונה המצביעה על תפקיד מורכב עבור כל תת-משפחה בוויסות תהליכים אוטופגיים ולא אוטופגיים. הדבר מאושש עוד יותר על ידי רשת מורכבת של שינויים פוסט-תרגומיים המווסתים את פעילות ATG4B באמצעות זרחון, אצטילציה, גליקוזילציה וניטרוסילציה 9,10,11,12,13.
מספר מעכבי ATG4B ידועים פורסמו 2,4,14,15. בעוד אלה מתאימים ככלי מחקר, הפרופיל הפרמקודינמי שלהם, סלקטיביות או עוצמה עדיין מנעו מהם לפתח כמועמדים פרה-קליניים 4,16. באופן כללי, יש צורך דחוף לזהות תרכובות חזקות וסלקטיביות יותר. לעתים קרובות, התרכובות הן מעכבות ביוכימיות טובות של תפקוד החלבון, אך יעילותן בבדיקות מבוססות תאים נמוכה. ישנן בדיקות מרובות לניטור פעילות ATG4B, כולל שיטות ביוכימיות ובדיקות מבוססות תאים4. פיתחנו בעבר בדיקה פשוטה, מבוססת לומינסנציה ובעלת תפוקה גבוהה לניטור פעילות ATG4B בתאים 8,17. בדיקה זו משתמשת בחלבון לוציפראז מנסיך גאוסיה (GLUC) שהוא יציב ופעיל בסביבה החוץ-תאית ויכול להשתחרר באופן אינדוקטיבי מתאים בתגובה לפעילות פרוטאוליטית ATG4B18,19.
במבנה כתב זה, dNGLUC מקושר לשלד האקטין של תאים. ניתן להכניס מקשר ספציפי לפרוטאז בין עוגן β אקטין לבין dNGLUC, מה שהופך את ההפרשה לתלויה במחשוף של המקשר. השתמשנו במסגרת קריאה פתוחה באורך מלא של LC3B בין β-actin ו-dNGLUC, כדי להיות מסוגלים לנטר מחשוף LC3B17,18,19. למרות שמנגנון ההפרשה של dNGLUC אינו מובן היטב, הוא ספציפי לניטור פעילות ATG4B, אינו תלוי באוטופגיה כללית כפי שהיא מתרחשת בתאי נוקאאוט ATG5, ומתווך על ידי מנגנונים לא קונבנציונליים שאינם דורשים פפטיד אות קלאסי 4,18,19. השתמשנו בהצלחה בכתב זה כדי לסנן מולקולות קטנות וספריות siRNA, וזיהינו רגולטורים חדשים של פעילות ATG4B, כגון חלבון Akt קינאזות8. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש בכתב לוציפראז זה בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.
פרוטוקול זה מתאר בדיקת גן דיווח מבוססת תאים לזיהוי מעכבי ATG4B. זיהוי פגיעות ראשוניות מבוסס על פעילות לוציפראז בטיפול בתאים המבטאים את מסגרת הקריאה הפתוחה באורך מלא של LC3B בין β-אקטין ל-dNGLUC. כמה יתרונות של בדיקה זו הם שזה רגיש, כמותי מאוד, ולא פולשני, כפי שהוא יכול לזהות dNGLUC מבלי לשקר את התאים. מ…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מימון ליבה של המועצה הבריטית למחקר רפואי ליחידת MRC-UCL University Grant Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (מענק 2018RIF_15), ותוכנית UCL Therapeutic Acceleration Support Scheme, הנתמכת על ידי מימון מ- MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. הפלסמיד המקודד ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) התקבל מד”ר רובין קטלר (המחלקה לרפואה אנושית, בית הספר לרפואה בברלין).
50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
Milli-Q water | deionized water | ||
Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |