ऑटोफैगी से संबंधित 4 बी सिस्टीन पेप्टिडेस के अवरोधकों के लिए सेल-आधारित दवा स्क्रीनिंग
Summary
यहां, हम अर्ध-स्वचालित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रारूप में ल्यूसिफेरस-आधारित रिपोर्टर परख के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
बढ़ते सबूतों से पता चला है कि उच्च ऑटोफैजिक फ्लक्स ट्यूमर की प्रगति और कैंसर चिकित्सा प्रतिरोध से संबंधित है। व्यक्तिगत ऑटोफैगी प्रोटीन का परीक्षण करना इस मार्ग को लक्षित करने वाली चिकित्सीय रणनीतियों के लिए एक शर्त है। ऑटोफैगी प्रोटीज एटीजी 4 बी का निषेध समग्र अस्तित्व को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है, यह सुझाव देते हुए कि एटीजी 4 बी कैंसर चिकित्सा के लिए एक संभावित दवा लक्ष्य हो सकता है। हमारी प्रयोगशाला ने कोशिकाओं में एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए एक चयनात्मक ल्यूसिफेरस-आधारित परख विकसित की है। इस परख के लिए, एटीजी 4 बी, एलसी 3 बी के सब्सट्रेट को सी-टर्मिनस पर समुद्री कोपपॉड गॉसिया प्रिंसेस (ग्लूक) से एक स्रावित ल्यूसिफेरस के साथ टैग किया गया है। यह रिपोर्टर एक्टिन साइटोस्केलेटन से जुड़ा हुआ है, इस प्रकार इसे अशुद्ध होने पर कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में रखता है। एटीजी 4 बी-मध्यस्थता दरार के परिणामस्वरूप गैर-पारंपरिक स्राव द्वारा ग्लूक की रिहाई होती है, जिसे तब सेलुलर एटीजी 4 बी गतिविधि के सहसंबंध के रूप में सेल कल्चर से सुपरनैटेंट की कटाई करके निगरानी की जा सकती है। यह पेपर स्वचालित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए इस ल्यूसिफेरस-आधारित परख के अनुकूलन को प्रस्तुत करता है। हम सेलुलर एटीजी 4 बी गतिविधि के अनुकरणीय उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो और अनुकूलन का वर्णन करते हैं।
Introduction
ऑटोफैगी एक संरक्षित चयापचय प्रक्रिया है जो कोशिकाओं को इंट्रासेल्युलर होमियोस्टैसिस रखने और लाइसोसोम 1,2,3 के माध्यम से वृद्ध, दोषपूर्ण या अनावश्यक सेलुलर सामग्री को कम करके तनाव का जवाब देने की अनुमति देती है। कुछ पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों के तहत, यह प्रक्रिया पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की कमी के लिए एक महत्वपूर्ण सेलुलर प्रतिक्रिया के रूप में कार्य करती है, जिसके परिणामस्वरूप पुनर्नवीनीकरण पोषक तत्व और लिपिड होते हैं, जिससे कोशिकाओं को उनकी चयापचय आवश्यकताओं 2,3,4 के अनुकूल होने की अनुमति मिलती है। ऑटोफैगी को कई बीमारियों से संबंधित सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया के रूप में भी पहचाना गया है, जैसे कि न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार, रोगज़नक़ संक्रमण और विभिन्न प्रकार के कैंसर। कैंसर में ऑटोफैगी का कार्य जटिल है और ट्यूमर के प्रकार, चरण और स्थिति पर निर्भर है। यह क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के ऑटोफैजिक क्षरण के माध्यम से ट्यूमरजेनिसिस को दबा सकता है, लेकिन तनावपूर्ण स्थितियों, जैसे हाइपोक्सिया, पोषक तत्वों की कमी और साइटोटोक्सिक क्षति 2,4,5,6 के दौरान सेल अस्तित्व में सुधार करके उन्नत ट्यूमर के अस्तित्व को भी बढ़ावा दे सकता है।
कई अध्ययनों से पता चला है कि ऑटोफैगी निषेध एक एंटीकैंसर रणनीति के रूप में लाभ प्रदान करता है। इस प्रकार, महत्वपूर्ण चरणों का निषेध, जैसे कि ऑटोफैगोसोम गठन या लाइसोसोम के साथ इसका संलयन, कैंसर नियंत्रण 2,4,5,6 के लिए एक प्रभावी तरीका हो सकता है। बढ़ते सबूतों से पता चला है कि एटीजी 4 बी कुछ रोग स्थितियों में शामिल है, और इसने संभावित एंटीकैंसर लक्ष्य 2,3,4 के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। उदाहरण के लिए, यह देखा गया कि कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं और मानव एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 (एचईआर 2) -पॉजिटिव स्तन कैंसर कोशिकाओं में आसन्न सामान्य कोशिकाओं 2,4 की तुलना में काफी अधिक एटीजी 4 बी अभिव्यक्ति स्तर थे। प्रोस्टेट कैंसर कोशिकाओं में, एटीजी 4 बी के निषेध के परिणामस्वरूप कीमोथेरेपी और रेडियोथेरेपी7 के लिए एक सेल लाइन-विशिष्ट संवेदनशीलता हुई। हाल ही में, मजबूत सबूत सामने आए हैं कि अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) विशेष रूप से एटीजी 4 बी निषेध के लिए कमजोर है। उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल में, यह दिखाया गया था कि एटीजी 4 बी फ़ंक्शन का आंतरायिक नुकसान पीडीएसी ट्यूमर के विकास को कम करता है और अस्तित्व को बढ़ाता है 3,4। कुल मिलाकर, एटीजी 4 बी कुछ कैंसर प्रकारों में अत्यधिक अतिरंजित है, ट्यूमर की प्रगति से संबंधित है, और कैंसर चिकित्सा प्रतिरोध 2,4,8 से जुड़ा हुआ है।
स्तनधारियों में एटीजी 4 सिस्टीन प्रोटीज में चार परिवार के सदस्य होते हैं, एटीजी 4 ए-एटीजी 4 डी। ये प्रोटीन 9,10,11 प्रोटीन के एलसी 3 / जीएबीएआरएपी (एटीजी 8) परिवार की ओर कुछ लक्ष्य चयनात्मकता प्रदर्शित करते हैं और उनके अतिरिक्त कार्य हो सकते हैं जो उनकी प्रोटीज गतिविधि12,13 से जुड़े नहीं हैं। इसके अलावा, एटीजी 4 एक नए प्रकार के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन को विनियमित करने में कार्य करता है, प्रोटीन11,12 का एटीजी 8-नाइलेशन। जबकि एटीजी 4 बी और इसके मुख्य सब्सट्रेट एलसी 3 बी का सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया जाता है, एक तस्वीर उभर रही है जो ऑटोफैजिक और गैर-ऑटोफैजिक प्रक्रियाओं के विनियमन में प्रत्येक उप-परिवार के सदस्य के लिए एक जटिल भूमिका का सुझाव देती है। यह पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के एक जटिल नेटवर्क द्वारा पुष्टि की जाती है जो फॉस्फोराइलेशन, एसिटिलीकरण, ग्लाइकोसिलेशन और नाइट्रोसिलेशन9,10,11,12,13 के माध्यम से एटीजी 4 बी गतिविधि को नियंत्रित करते हैं।
कई ज्ञात एटीजी 4 बी अवरोधक 2,4,14,15 प्रकाशित किए गए हैं। हालांकि ये अनुसंधान उपकरण के रूप में उपयुक्त हैं, उनकी फार्माकोडायनामिक प्रोफाइल, चयनात्मकता, या शक्ति ने अभी तक उन्हें प्रीक्लिनिकल उम्मीदवारों 4,16 के रूप में विकास से रोक दिया है। कुल मिलाकर, अधिक शक्तिशाली और चयनात्मक यौगिकों की पहचान करने की तत्काल आवश्यकता है। अक्सर, यौगिक प्रोटीन फ़ंक्शन के अच्छे जैव रासायनिक अवरोधक होते हैं, फिर भी सेल-आधारित परख में उनकी प्रभावकारिता खराब होती है। एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए कई परख हैं, जिनमें जैव रासायनिक तरीके और सेल-आधारित परख4 शामिल हैं। हमने पहले कोशिकाओं 8,17 में एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए एक सरल, ल्यूमिनेसेंस-आधारित, उच्च-थ्रूपुट परख विकसित की है। यह परख गॉसिया प्रिंसेस (ग्लूक) से एक ल्यूसिफेरस प्रोटीन का उपयोग करती है जो बाह्य वातावरण में स्थिर और सक्रिय है और एटीजी 4 बी प्रोटियोलिटिक गतिविधि18,19 के जवाब में कोशिकाओं से अपरिहार्य रूप से जारी किया जा सकता है।
इस रिपोर्टर निर्माण में, डीएनजीएलयूसी कोशिकाओं के एक्टिन साइटोस्केलेटन से जुड़ा हुआ है। β-एक्टिन एंकर और डीएनग्लूक के बीच एक प्रोटीज-विशिष्ट लिंकर पेश किया जा सकता है, जिससे स्राव लिंकर के दरार पर निर्भर हो जाता है। हमने एलसी 3 बी दरार17,18,19 की निगरानी करने में सक्षम होने के लिए β-एक्टिन और डीएनएलयूसी के बीच एलसी 3 बी के पूर्ण लंबाई वाले ओपन रीडिंग फ्रेम का उपयोग किया। यद्यपि डीएनजीएलयूसी के स्राव तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है, यह एटीजी 4 बी गतिविधि की निगरानी के लिए विशिष्ट है, समग्र ऑटोफैगी पर निर्भर नहीं करता है क्योंकि यह एटीजी 5 नॉकआउट कोशिकाओं में होता है, और गैर-पारंपरिक तंत्र द्वारा मध्यस्थता की जाती है जिसे शास्त्रीय सिग्नल पेप्टाइड 4,18,19 की आवश्यकता नहीं होती है। हमने इस रिपोर्टर का उपयोग सफलतापूर्वक छोटे अणुओं और सीआरएनए पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए किया है, और एटीजी 4 बी गतिविधि के नए नियामकों की पहचान की है, जैसे कि एकेटी प्रोटीन किनेसेस8। यह पेपर अर्ध-स्वचालित, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रारूप में इस ल्यूसिफेरस रिपोर्टर के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एटीजी 4 बी अवरोधकों की पहचान के लिए एक सेल-आधारित रिपोर्टर-जीन परख का वर्णन करता है। प्राथमिक हिट की पहचान β-एक्टिन और डीएनएलयूसी के बीच एलसी 3 बी के पूर्ण लंबाई वाले ओपन रीडिंग फ्रेम को व्यक?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल द्वारा एमआरसी-यूसीएल यूनिवर्सिटी यूनिट ग्रांट रेफ MC_U12266B, एमआरसी डिमेंशिया प्लेटफॉर्म ग्रांट यूके एमआर / M02492X/1, अग्नाशय ी कैंसर यूके (अनुदान संदर्भ 2018RIF_15), और यूसीएल चिकित्सीय त्वरण सहायता योजना के लिए कोर फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था, जो अवधारणा 2020 यूसीएल एमसी / पीसी / 19054 में एमआरसी विश्वास से वित्त पोषण द्वारा समर्थित था। एक्टिनएलसी 3 डीएनजीएलयूसी (पीएमओडब्ल्यूएस-एक्टिनएलसी 3 डीएनजीएलयूसी) को एन्कोडिंग करने वाला प्लास्मिड डॉ रॉबिन केटलर (मानव चिकित्सा विभाग, मेडिकल स्कूल बर्लिन) से प्राप्त किया गया था।
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
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