자가포식 관련 4B 시스테인 펩티다아제 억제제에 대한 세포 기반 약물 스크리닝
Summary
여기에서는 반자동 고처리량 스크리닝 형식으로 루시페라아제 기반 리포터 분석을 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
높은 자가포식 플럭스가 종양 진행 및 암 치료 내성과 관련이 있다는 증거가 늘어나고 있습니다. 개별 자가포식 단백질을 분석하는 것은 이 경로를 표적으로 하는 치료 전략의 전제 조건입니다. 자가포식 프로테아제 ATG4B의 억제는 전체 생존율을 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 ATG4B가 암 치료의 잠재적인 약물 표적이 될 수 있음을 시사합니다. 우리 실험실은 세포에서 ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 선택적 루시페라아제 기반 분석을 개발했습니다. 이 분석을 위해 ATG4B, LC3B의 기질은 해양 요각류 Gaussia princeps(GLUC)의 비밀 루시페라아제로 C-말단에 태그됩니다. 이 리포터는 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)에 연결되어 있어, 세포가 없어졌을 때 세포의 세포질에 보관되어 있다. ATG4B 매개 절단은 비전통적 분비에 의해 GLUC의 방출을 초래하며, 세포 ATG4B 활성의 상관 관계로서 세포 배양에서 상층액을 수확하여 모니터링할 수 있습니다. 이 논문은 이 루시페라아제 기반 분석법을 자동화된 고처리량 스크리닝에 적용하는 방법을 제시합니다. 세포 ATG4B 활성의 모범적인 고처리량 분석을 위한 워크플로우 및 최적화에 대해 설명합니다.
Introduction
자가포식은 세포가 세포 내 항상성을 유지하고 리소좀 1,2,3을 통해 노화되거나 결함이 있거나 불필요한 세포 내용물을 분해하여 스트레스에 반응할 수 있도록 하는 보존된 대사 과정입니다. 일부 병태생리학적 조건에서 이 과정은 영양소 및 산소 결핍에 대한 중요한 세포 반응으로 작용하여 재활용된 영양소와 지질을 생성하여 세포가 대사 요구에 적응할 수 있도록 합니다 2,3,4. 자가포식은 또한 신경퇴행성 질환, 병원체 감염 및 다양한 유형의 암과 같은 여러 질병과 관련된 세포 스트레스 반응으로 확인되었습니다. 암에서 자가포식의 기능은 복잡하며 종양의 유형, 병기 및 상태에 따라 달라집니다. 손상된 세포의 자가포식 분해를 통해 종양 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 저산소증, 영양 결핍 및 세포독성 손상과 같은 스트레스 조건에서 세포 생존을 개선하여 진행성 종양의 생존을 촉진할 수 있습니다 2,4,5,6.
여러 연구에 따르면 자가포식 억제는 항암 전략으로 이점을 제공합니다. 따라서, 자가포식체 형성 또는 리소좀과의 융합과 같은 중요한 단계의 억제는 암 조절을 위한 효과적인 방법이 될 수 있다 2,4,5,6. ATG4B가 특정 병리학적 상태에 관여한다는 증거가 늘어나고 있으며, 잠재적인 항암 표적 2,3,4로 주목받고 있습니다. 예를 들어, 대장암 세포와 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 양성 유방암 세포는 인접한 정상 세포보다 ATG4B 발현 수준이 유의하게 높은 것으로 관찰되었습니다 2,4. 전립선암 세포에서 ATG4B의 억제는 화학요법 및 방사선요법에 대한 세포주 특이적 감수성을 초래했다7. 최근 췌관 선암(PDAC)이 ATG4B 억제에 특히 취약하다는 강력한 증거가 나타났습니다. 예를 들어, 유전자 조작 마우스 모델에서 ATG4B 기능의 간헐적 손실은 PDAC 종양 성장을 감소시키고 생존을 증가시키는 것으로 나타났습니다 3,4. 전반적으로, ATG4B는 일부 암 유형에서 매우 과발현되고, 종양의 진행과 관련이 있으며, 암 치료 내성과 관련이 있다 2,4,8.
포유류의 ATG4 시스테인 프로테아제에는 ATG4A-ATG4D의 4가지 가족 구성원이 있습니다. 이들 단백질은 단백질 9,10,11의 LC3/GABARAP (ATG8) 계열에 대해 일부 표적 선택성을 나타내며 이들의 프로테아제 활성과 연결되지 않은 추가 기능을 가질 수 있다12,13. 또한, ATG4는 새로운 유형의 번역 후 변형, 단백질11,12의 ATG8-ylation을 조절하는 기능을 합니다. ATG4B와 그 주요 기질 LC3B가 가장 널리 연구되고 있지만, 자가포식 및 비자가포식 과정의 조절에서 각 아과 구성원에 대한 복잡한 역할을 시사하는 그림이 나타나고 있습니다. 이는 인산화(phosphorylation), 아세틸화(acetylation), 글리코실화(glycosylation) 및 니트로실화(nitrosylation) 9,10,11,12,13을 통해 ATG4B 활성을 조절하는 번역 후 변형(post-translational modification)의 복잡한 네트워크에 의해 더욱 확증된다.
여러 가지 알려진 ATG4B 억제제가발표되었습니다 2,4,14,15. 이들은 연구 도구로 적합하지만 약력학적 프로파일, 선택성 또는 효능으로 인해 아직 전임상 후보 물질로 개발되지 못했습니다 4,16. 전반적으로, 더 강력하고 선택적인 화합물을 식별하는 것이 시급합니다. 종종 화합물은 단백질 기능의 우수한 생화학적 억제제이지만 세포 기반 분석에서는 효능이 좋지 않습니다. ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 여러 분석법이 있으며, 여기에는 생화학적 방법과 세포 기반 분석법이포함된다 4. 우리는 이전에 세포 8,17에서 ATG4B 활성을 모니터링하기 위한 간단한 발광 기반 고처리량 분석을 개발했습니다. 이 분석법은 세포외 환경에서 안정적이고 활성이 높으며 ATG4B 단백질 분해 활성에 반응하여 세포에서 유도적으로 방출될 수 있는 가우시아 프린셉스(GLUC)의 루시페라아제 단백질을 사용합니다18,19.
이 리포터 구조에서 dNGLUC는 세포의 액틴 세포골격에 연결되어 있습니다. 프로테아제 특이적 링커는 β-actin anchor와 dNGLUC 사이에 도입될 수 있으며, 링커의 절단에 따라 분비물을 전환할 수 있습니다. LC3B 절단17,18,19를 모니터링할 수 있도록 β-actin과 dNGLUC 사이에 있는 LC3B의 전체 길이 개방 판독 프레임을 사용했습니다. dNGLUC의 분비 메커니즘은 잘 알려져 있지 않지만 ATG4B 활성을 모니터링하는 데 특이적이며 ATG5 녹아웃 세포에서 발생하기 때문에 전체 자가포식에 의존하지 않으며 고전적인 신호 펩타이드 4,18,19를 필요로 하지 않는 비전통적인 메커니즘에 의해 매개됩니다. 우리는 이 리포터를 사용하여 저분자 및 siRNA 라이브러리를 성공적으로 스크리닝했으며 Akt 단백질 키나아제8과 같은 ATG4B 활성의 새로운 조절자를 식별했습니다. 이 논문은 이 루시페라아제 리포터를 반자동, 고처리량 스크리닝 형식으로 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 ATG4B 억제제의 식별을 위한 세포 기반 리포터 유전자 분석을 설명합니다. 1차 히트의 식별은 β-actin과 dNGLUC 사이에서 LC3B의 전체 길이 개방 판독 프레임을 발현하는 세포 처리에 따른 루시페라아제 활성을 기반으로 합니다. 이 분석법의 몇 가지 장점은 세포를 용해하지 않고 dNGLUC를 검출할 수 있기 때문에 민감하고 정량이 많으며 비침습적이라는 것입니다. 이 논문은 안정적인 세포?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 MRC-UCL 대학 단위 보조금 Ref MC_U12266B, MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK(보조금 참조 2018RIF_15) 및 MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054의 자금 지원을 받는 UCL Therapeutic Acceleration Support 계획에 대한 영국 의학 연구 위원회의 핵심 자금 지원을 받았습니다. ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC)를 암호화하는 플라스미드는 Dr. Robin Ketteler (베를린 의과대학 인간 의학과)로부터 수득하였다.
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
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