Detección de fármacos basados en células para inhibidores de la 4B cisteína peptidasa relacionada con la autofagia
Summary
Aquí, describimos un protocolo detallado para el uso de un ensayo reportero basado en luciferasa en un formato de cribado semiautomatizado de alto rendimiento.
Abstract
Cada vez hay más pruebas de que el flujo autofágico alto se relaciona con la progresión tumoral y la resistencia a la terapia contra el cáncer. El ensayo de proteínas individuales de autofagia es un requisito previo para las estrategias terapéuticas dirigidas a esta vía. Se ha demostrado que la inhibición de la proteasa de autofagia ATG4B aumenta la supervivencia general, lo que sugiere que ATG4B podría ser una posible diana farmacológica para el tratamiento del cáncer. Nuestro laboratorio ha desarrollado un ensayo selectivo basado en luciferasa para monitorizar la actividad de ATG4B en células. Para este ensayo, el sustrato de ATG4B, LC3B, se marca en el extremo C-terminal con una luciferasa secretable del copépodo marino Gaussia princeps (GLUC). Este reportero está unido al citoesqueleto de actina, manteniéndolo así en el citoplasma de las células cuando no se separa. La escisión mediada por ATG4B da lugar a la liberación de GLUC por secreción no convencional, que luego puede monitorizarse mediante la recolección de sobrenadantes de cultivos celulares como correlato de la actividad celular de ATG4B. En este trabajo se presenta la adaptación de este ensayo basado en luciferasa al cribado automatizado de alto rendimiento. Describimos el flujo de trabajo y la optimización para un análisis ejemplar de alto rendimiento de la actividad celular de ATG4B.
Introduction
La autofagia es un proceso metabólico conservado que permite a las células mantener la homeostasis intracelular y responder al estrés degradando el contenido celular envejecido, defectuoso o innecesario a través de los lisosomas 1,2,3. En algunas condiciones fisiopatológicas, este proceso actúa como una respuesta celular crucial a la privación de nutrientes y oxígeno, lo que resulta en nutrientes y lípidos reciclados, lo que permite que las células se adapten a sus necesidades metabólicas 2,3,4. La autofagia también se ha identificado como una respuesta al estrés celular relacionada con varias enfermedades, como trastornos neurodegenerativos, infecciones por patógenos y varios tipos de cáncer. La función de la autofagia en el cáncer es compleja y depende del tipo, el estadio y el estado del tumor. Puede suprimir la tumorigénesis a través de la degradación autofágica de las células dañadas, pero también puede promover la supervivencia de los tumores avanzados al mejorar la supervivencia celular durante condiciones estresantes, como la hipoxia, la privación de nutrientes y el daño citotóxico 2,4,5,6.
Varios estudios han demostrado que la inhibición de la autofagia proporciona un beneficio como estrategia contra el cáncer. Así, la inhibición de pasos críticos, como la formación de autofagosomas o su fusión con el lisosoma, podría ser un método eficaz para el control del cáncer 2,4,5,6. Cada vez hay más pruebas que demuestran que ATG4B está implicado en ciertas condiciones patológicas, y ha ganado atención como una posible diana anticancerígena 2,3,4. Por ejemplo, se observó que las células de cáncer colorrectal y las células de cáncer de mama positivas para el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) tenían niveles de expresión de ATG4B significativamente más altos que las células normales adyacentes 2,4. En las células de cáncer de próstata, la inhibición de ATG4B dio lugar a una susceptibilidad específica de la línea celular a la quimioterapia y la radioterapia7. Recientemente, ha surgido evidencia sólida de que el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es particularmente vulnerable a la inhibición de ATG4B. Por ejemplo, en un modelo de ratón modificado genéticamente, se demostró que la pérdida intermitente de la función de ATG4B reduce el crecimiento tumoral de PDAC y aumenta la supervivencia 3,4. En general, ATG4B está altamente sobreexpresado en algunos tipos de cáncer, se relaciona con la progresión del tumor y se relaciona con la resistencia a la terapia contra el cáncer 2,4,8.
Las proteasas de cisteína ATG4 en mamíferos tienen cuatro miembros de la familia, ATG4A-ATG4D. Estas proteínas exhiben cierta selectividad hacia la familia de proteínas LC3/GABARAP (ATG8) 9,10,11 y pueden tener funciones adicionales no relacionadas con su actividad proteasa12,13. Además, ATG4 funciona en la regulación de un nuevo tipo de modificación postraduccional, la ATG8-ilación de proteínas11,12. Si bien ATG4B y su sustrato principal LC3B son los más estudiados, está surgiendo un panorama que sugiere un papel complejo para cada miembro de la subfamilia en la regulación de los procesos autofágicos y no autofágicos. Esto se corrobora aún más por una compleja red de modificaciones postraduccionales que regulan la actividad de ATG4B a través de la fosforilación, acetilación, glicosilación y nitrosilación 9,10,11,12,13.
Se han publicado varios inhibidores conocidos de ATG4B 2,4,14,15. Si bien estos son adecuados como herramientas de investigación, su perfil farmacodinámico, selectividad o potencia aún no los han desarrollado como candidatos preclínicos 4,16. En general, existe una necesidad urgente de identificar compuestos más potentes y selectivos. A menudo, los compuestos son buenos inhibidores bioquímicos de la función de las proteínas, pero su eficacia en los ensayos basados en células es pobre. Existen múltiples ensayos para monitorizar la actividad de ATG4B, incluyendo métodos bioquímicos y ensayos basados en células4. Anteriormente hemos desarrollado un ensayo simple, basado en luminiscencia y de alto rendimiento para monitorear la actividad de ATG4B en las celdas 8,17. Este ensayo utiliza una proteína luciferasa de Gaussia princeps (GLUC) que es estable y activa en el medio extracelular y puede ser liberada induciblemente de las células en respuesta a la actividad proteolítica ATG4B18,19.
En esta construcción reportera, dNGLUC está ligada al citoesqueleto de actina de las células. Se puede introducir un enlazador específico de proteasa entre el anclaje de β-actina y dNGLUC, haciendo que la secreción dependa de la escisión del enlazador. Utilizamos el marco de lectura abierto de longitud completa de LC3B entre β-actina y dNGLUC, para poder monitorizar la escisión de LC3B17,18,19. Aunque el mecanismo de secreción de dNGLUC es poco conocido, es específico para monitorizar la actividad de ATG4B, no depende de la autofagia global como ocurre en las células knockout de ATG5 y está mediado por mecanismos no convencionales que no requieren un péptido señal clásico 4,18,19. Hemos utilizado con éxito este reportero para cribar moléculas pequeñas y bibliotecas de siRNA, y hemos identificado nuevos reguladores de la actividad de ATG4B, como las proteínas quinasasAkt 8. En este trabajo se describe un protocolo detallado para el uso de este reportero de luciferasa en un formato de cribado semiautomático y de alto rendimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un ensayo de genes reporteros basado en células para la identificación de inhibidores de ATG4B. La identificación de los aciertos primarios se basa en la actividad de la luciferasa en el tratamiento de las células que expresan el marco de lectura abierto de longitud completa de LC3B entre la β-actina y el dNGLUC. Algunas ventajas de este ensayo son que es sensible, altamente cuantitativo y no invasivo, ya que puede detectar dNGLUC sin lisar las células. En este trabajo se presenta un protoco…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la financiación básica del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido para la Subvención de la Unidad Universitaria MRC-UCL Ref MC_U12266B, la Subvención de la Plataforma de Demencia del MRC del Reino Unido MR/M02492X/1, el Cáncer de Páncreas del Reino Unido (referencia de la subvención 2018RIF_15) y el programa de Apoyo a la Aceleración Terapéutica de la UCL, con el apoyo de la financiación de MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. El plásmido que codifica la ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC) se obtuvo del Dr. Robin Ketteler (Departamento de Medicina Humana, Facultad de Medicina de Berlín).
Materials
| 50 µL Disposable Tips – Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
| BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
| Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
| EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
| Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
| FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
| Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate – 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
| Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
| Milli-Q water | deionized water | ||
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
| PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
| pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
| Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
| Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
| X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
Riferimenti
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