Ex Vivo Culture de perfusion de gros vaisseaux sanguins dans un bioréacteur imprimé en 3D
Summary
Ce protocole présente la mise en place et le fonctionnement d’un bioréacteur nouvellement développé, imprimé en 3D, pour la culture ex vivo de vaisseaux sanguins en perfusion. Le système est conçu pour être facilement adopté par d’autres utilisateurs, pratique, abordable et adaptable à différentes applications expérimentales, telles que la biologie fondamentale et les études pharmacologiques.
Abstract
Les maladies vasculaires sont à la base de la plupart des maladies cardiovasculaires (MCV), qui restent la première cause de mortalité et de morbidité dans le monde. Des interventions chirurgicales et pharmacologiques efficaces pour prévenir et traiter les maladies vasculaires sont nécessaires de toute urgence. En partie, le manque de modèles translationnels limite la compréhension des processus cellulaires et moléculaires impliqués dans les maladies vasculaires. Les bioréacteurs de culture de perfusion ex vivo offrent une plate-forme idéale pour l’étude de grands vaisseaux animaux (y compris humains) dans un environnement dynamique contrôlé, combinant la facilité de la culture in vitro et la complexité du tissu vivant. La plupart des bioréacteurs sont cependant fabriqués sur mesure et donc difficiles à adopter, ce qui limite la reproductibilité des résultats. Cet article présente un système imprimé en 3D qui peut être facilement produit et appliqué dans n’importe quel laboratoire biologique, et fournit un protocole détaillé pour sa configuration, permettant aux utilisateurs de l’utiliser. Ce système de culture de perfusion ex vivo innovant et reproductible permet la culture de vaisseaux sanguins jusqu’à 7 jours dans des conditions physiologiques. Nous nous attendons à ce que l’adoption d’un bioréacteur de perfusion normalisé favorise une meilleure compréhension des processus physiologiques et pathologiques dans les gros vaisseaux sanguins des animaux et accélère la découverte de nouveaux traitements.
Introduction
La paroi vasculaire existe dans un état d’équilibre réactif, ce qui assure à la fois des réceptivités aux stimuli externes (c’est-à-dire un changement de pression, des vasoconstricteurs) et une surface constante non activatrice empêchant la coagulation sanguine et l’infiltration de cellules inflammatoires1. En réponse à des stimuli liés au vieillissement et au mode de vie et à des dommages directs, la paroi vasculaire active des processus de remodelage tels que la resténose et l’athérosclérose, qui sont des contributeurs connus aux maladies cardiovasculaires courantes (MCV), telles que l’accident vasculaire cérébral ischémique et l’infarctus du myocarde2. Bien que des approches interventionnelles telles que la revascularisation percutanée et la pose d’endoprothèses soient disponibles pour lutter contre les manifestations avancées de la maladie vasculaire, elles sont connues pour provoquer d’autres lésions vasculaires, conduisant souvent à des récidives. De plus, seules des solutions préventives et précoces limitées sont disponibles. Comprendre les mécanismes qui maintiennent l’homéostasie de la paroi vasculaire et pilotent son dysfonctionnement est au cœur du développement de nouveaux remèdes3.
Malgré le développement et les progrès constants de la biologie moléculaire et de l’ingénierie tissulaire, les études animales restent une composante cruciale des études de biologie vasculaire. Des études in vivo chez l’animal ont permis de mieux comprendre les mécanismes de l’homéostasie vasculaire et de la pathologie. Cependant, ces procédures sont coûteuses, ont un débit relativement faible et posent des problèmes éthiques importants. De plus, les petits animaux sont peu représentatifs de la physiologie vasculaire humaine, et les expériences sur les grands animaux sont beaucoup plus coûteuses et créent d’autres considérations éthiques 4,5. Avec la demande croissante de solutions pharmaceutiques et médicales pour une population vieillissante rapide, les inconvénients de l’utilisation d’animaux sont amplifiés, ce qui a un impact sur la reproductibilité, la fiabilité et la transférabilité des résultats pour les soins aux patients6.
Les systèmes in vitro offrent une plate-forme simplifiée pour étudier les mécanismes de base, mais ne parviennent pas à récapituler la complexité de l’ensemble du tissu, les interactions entre les cellules et la matrice extracellulaire, et les forces mécaniques, qui sont des déterminants critiques dans le développement des maladies vasculaires7.
Les études ex vivo réalisées sur des tissus entiers maintenus dans des environnements contrôlés artificiellement imitent la complexité in vivo tout en permettant des investigations à débit relativement élevé8. Compte tenu de la capacité à contrôler étroitement les conditions de culture et l’environnement, les modèles ex vivo permettent un large éventail d’études complexes et offrent une alternative appropriée pour réduire l’utilisation de procédures animales en biologie vasculaire. Les cultures d’anneaux vasculaires statiques ont offert des informations intéressantes, mais n’ont pas réussi à intégrer l’élément hémodynamique crucial9. En effet, l’étude ex vivo du système vasculaire pose des défis spécifiques liés aux nombreuses forces dynamiques qui s’appliquent aux cellules de la paroi des vaisseaux sanguins. Les stimuli tels que l’écoulement luminal, la turbulence, la contrainte de cisaillement, la pression et la déformation de la paroi ont un impact significatif sur la physiopathologie tissulaire10,11,12.
Les bioréacteurs de perfusion sont essentiels pour étudier l’homéostasie vasculaire et le remodelage en réponse à une blessure ou à des changements hémodynamiques13. De plus, la culture par perfusion peut être utilisée pour améliorer la maturation et la durabilité des vaisseaux sanguins issus de l’ingénierie tissulaire (TEBV), offrant ainsi des alternatives appropriées pour les greffes vasculaires14.
Les bioréacteurs de perfusion disponibles dans le commerce ont une flexibilité et une adaptabilité limitées et sont coûteux. De nombreux bioréacteurs existants développés en interne sont difficiles à reproduire dans d’autres laboratoires, en raison des descriptions limitées et de l’indisponibilité des composants spécialement fabriqués 7,8,9,10,11,12. Pour surmonter ces limitations, nous avons récemment mis au point un nouveau bioréacteur (EasyFlow), qui est économique à produire, qui s’adapte à une gamme de tissus et permet des modifications relativement simples pour s’adapter aux différentes exigences de la recherche13. L’insert est imprimé en 3D et s’adapte comme dans le couvercle d’un tube à centrifuger standard de 50 ml. Sa conception modulaire et sa fabrication par impression 3D le rendent accessible et reproductible dans différents laboratoires, ainsi que facilement modifiable pour s’adapter aux différents besoins scientifiques. Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement de base du système de bioréacteur dans un contexte de perfusion artérielle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les systèmes de perfusion vasculaire ex vivo constituent une plate-forme unique pour étudier la fonction et le comportement des cellules vasculaires dans leurs tissus natifs dans des conditions contrôlées, ce qui permet de disséquer des processus complexes tels que le remodelage vasculaire post-lésion22. Cependant, la plupart des bioréacteurs signalés sont des systèmes fabriqués en interne et basés sur des composants sur mesure et sont souvent difficiles à reproduire par d’a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Centre de pathologie vétérinaire de l’École de médecine vétérinaire de l’Université de Surrey pour les services d’histologie. Nous remercions également les Drs L. Dixon, A. Reis et M. Henstock de l’Institut Pirbright (Pirbright, Royaume-Uni) pour leur soutien dans l’approvisionnement en tissus animaux, ainsi que le Département des sciences biochimiques de l’Université de Surrey, en particulier l’équipe technique, pour leur soutien continu. RSM a été soutenu par la bourse d’études du Doctoral College (Université de Surrey), DM et PC ont été soutenus par le Centre national pour le remplacement, le raffinement et la réduction des animaux dans la recherche (numéros de subvention : NC/R001006/1 et NC/T001216/1).
Materials
| EasyFlow | – | – | 3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs |
| PA12 – 3D printing | Protolabs | – | – |
| Peristaltic pump | Heidolph | PD5201 | |
| Culture media components: | |||
| Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water | Sigma-Aldrich | A2942-20ML | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | D8802-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | D6429-6X500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Immunostaining materials: | |||
| Cryostat | LEICA | CM3050 S | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10ML | |
| Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Invitrogen eBioscience Fluoromount G | Thermo Fisher Scientific | 50-187-88 | |
| MX35 Premier + Microtome Blade | Thermo Scientific | 3052835 | |
| Optimal Cooling Tempearure Compound – OCT | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Rabbit α-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| Sudan Black B | Santa Cruz Biotechnology | SC-203760 | |
| X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box | Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody | R&D Systems | IC1420R | |
| Material for laser cutting of components: | |||
| Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of washers) | RS Components | 258-6590 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Optional pressure monitors: | |||
| Pressure sensor | Parker Hannifin | 080-699PSX-3P-5 | |
| SciPres Pressure Monitor | Parker Hannifin | 206-200-M | |
| Pre-sterilized single use plasticware: | |||
| 0.2 um filter | Sarstedt | 70.1114.210 | |
| 20 mL Sterile syringe | IMS Euro | 40004 | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Thermo Fisher Scientific | Sarstedt – 62.547.254 | |
| Small components: | |||
| Cable ties | – | – | |
| Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb | Cole-Parmer | WZ-30800-10 | Barb Adaptor |
| Masterflex Polycarbonate Luer Fittings | Cole-Parmer | AU-45504-84 | |
| Nylon Miniature Check Valve | Cole-Parmer | 98553-00 | |
| RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of silicone seals) | RS Components | 840-5541 | |
| Stainless Steel M2 Hex Nuts | RS Components | 527-218 | |
| Stainless Steel M2 x 6 mm Screws | RS Components | 418-7426 | |
| Stainless Steel M5 Hex Nuts | RS Components | 189-585 | |
| Surgical vessel loop | Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies | 10-1003 | |
| Three-way valves | IMS Euro | 91000 | |
| Surgical Equipment | |||
| Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07 | International Medical Supplies | SKU: BD-07 | |
| Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm | International Medical Supplies | SKU: BD-361 | |
| Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm | International Medical Supplies | SKU: FD-12 | |
| Troge Surgical Scalpels – Size 23 – Box of 100 | International Medical Supplies | 63114 | |
| Tubing: | |||
| Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm) | Eppendorf | M0740-2396 | System tubing |
| Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing | ISMATEC | 95714-48 | Soft wall tubing (for clamp) |
| RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone | RS Components | 667-8432 | Resistance tubing (small inner diameter) |
| Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm) | Heidolph | 525-30027-00-0 | One way valve tube |
| Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene | RS Components | 125-4042 | Pump Tubing |
Riferimenti
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