実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント
Summary
同期時系列実験を分析する際の課題の1つは、実験によって同期からの回復の長さと細胞周期期間が異なることが多いことです。したがって、異なる実験からの測定値をまとめて分析したり、容易に比較したりすることはできません。ここでは、フェーズ固有の比較を可能にするために実験を調整する方法について説明します。
Abstract
細胞周期の調査は、多くの場合、細胞集団を同期させて、細胞が細胞周期を通過するときに時系列のさまざまなパラメータを測定することに依存します。しかし、同様の条件下でも、複製実験では、同期からの回復と細胞周期の横断に必要な時間に違いが見られるため、各時点で直接比較することはできません。実験間で動的測定値を比較するという問題は、突然変異集団または同期回復時間および/または細胞周期期間に影響を与える代替増殖条件で悪化します。
私たちは以前、細胞の同期集団がどのように同期から解放され、細胞周期を通して進行するかを監視する、細胞周期同期の喪失の特徴付け(CLOCCS)という名前のパラメトリック数学モデルを公開しました。次に、モデルから学習したパラメータを使用して、同期時系列実験の実験時点を正規化された時間スケール(生存線点)に変換できます。ライフラインスケールは、実験開始からの経過時間を分単位で表すのではなく、同期から細胞周期への進入、そして細胞周期の段階までの進行を表します。ライフラインポイントは、同期された母集団内の平均細胞の位相に対応するため、この正規化された時間スケールにより、さまざまな期間や回復時間を含む実験間の直接比較が可能になります。さらに、このモデルは、異なる種(例えば、サッカロミセス・セレビシエおよびシゾサッカロミセス・ポンベ)間の細胞周期実験を調整するために使用されているため、細胞周期測定値の直接比較が可能になり、進化の類似点と相違点が明らかになる可能性があります。
Introduction
細胞周期の進行に合わせて同期した細胞集団に対して行われる時系列測定は、細胞周期の進行を制御するメカニズムを調べるための標準的な方法です1、2、3、4、5、6、7、8.同期/リリース時系列実験間で比較を行う機能は、これらの動的プロセスを理解するために不可欠です。調査結果を裏付けるために反復実験を使用すると、結論の再現性の信頼性を高めることができます。さらに、環境条件間、変異体間、さらには種間の比較により、細胞周期制御に関する多くの新しい洞察を明らかにすることができます。しかし、同期からの回復と細胞周期の進行速度における実験間のばらつきは、反復間または細胞周期のタイミングを変更した実験間で時間ポイント間の比較を行う能力を損ないます。これらの課題のため、反復は完全な時系列に含まれないことがよくあります(例:Spellman et al.4)。時系列全体の反復が収集される場合、データを集計して分析することはできず、単一の反復が分析に使用され、他の反復はしばしば補足的な数値に追いやられます(例:Orlando et al.8)。さらに、異なる回復または細胞周期進行特性を有する実験間の比較は困難である。関心のあるイベントと細胞周期のランドマーク(芽の出現、S期の開始、後期の開始など)の間のより短い間隔の測定は、これらのランドマークイベントが追跡される場合のエラーを減らすのに役立ちます1、2、3、9、10、11、12。ただし、微妙ではあるが重要な違いは、これらのアドホックな方法を使用しても検出されないか、不明瞭なままになる可能性があります。最後に、シングルセル解析では、同期やアライメントに頼らずに細胞周期の進行を解析することができますが13、シングルセル研究における大規模な測定は困難でコストがかかる可能性があります。
これらの困難を克服するために、同期集団で行われた時系列測定の分析を支援するために、細胞周期同期の喪失の特徴付け(CLOCCS)モデルを開発しました14,15。CLOCCSは、細胞周期の段階が同期から解放され、細胞周期が進行するときに、細胞周期の段階にわたる同期細胞の分布を記述する柔軟な数学的モデルです。分岐プロセスの枠組みにより、このモデルは、S. cerevisiaeで観察されたように、分裂後の母細胞と娘細胞の非対称性を説明することができますが、S. pombeなどの分裂によって分裂する生物にも有用です。モデルは、さまざまな測定タイプのセットから入力を受け取り、細胞周期のフェーズを指定できます。これは、経時的な出芽細胞の割合の測定を含む出芽細胞周期相データを取り込むことができ、出芽していないG1相の外側の細胞数の推定を可能にする14,15。このモデルは、DNA含有量を測定するフローサイトメトリーデータを取り込むこともできるため、G1からS、SからG2、MからG1への画期的な遷移の評価が可能になります15。蛍光形態マーカーは、細胞周期期を同定するためにも使用できます。ミオシンリング、核、および紡錘体極体(SPB)の蛍光標識を使用して細胞周期期を決定することができ、これらはCLOCCSモデル11に組み込まれました。しかしながら、これらの測定は、このプロトコルでは記載されない。さらに、セプテーションインデックスは、S. pombe14からのデータをモデル化するための入力として使用されました。したがって、このモデルは、さまざまな生物の細胞周期解析に使用でき、さらに拡張することができます。
CLOCCSは、入力データから複数のパラメータ(出芽率、DNA含有量など)の完全なベイズ推定を可能にするパラメトリックモデルです。これらのパラメータには、同期からの回復時間、細胞周期期間の長さ(母細胞と娘細胞について別々に推定)、および各時点での細胞の平均細胞周期位置が含まれます。これらのパラメータは、集団内の平均細胞の挙動を表し、研究者が各時点を生存線点として表される細胞周期位置にマッピングできるようにします。生存線点への変換は、CLOCCSパラメータラムダ(λ)とmu0(μ0)14,15に依存します。パラメータλは、母細胞の平均細胞周期周期に対応する。ただし、母娘遅延14,15のため、これは母細胞と娘細胞の両方を含む全集団の平均細胞周期期間ではありません。CLOCCSはさらに、母娘遅延に対応するパラメータデルタ(δ)を推論し、したがって、全集団の平均細胞周期期間の計算を可能にする。最後に、各実験は細胞周期同期からの解放後に開始されるため、同期法から回復するのに必要な時間は CLOCCS パラメーター μ0 で表されます。CLOCCSは、入力された細胞周期位相データにモデルを適合し、ランダムウォークマルコフ連鎖モンテカルロアルゴリズム14、15を使用してこれらのパラメータを推論します。複数の実験を共通の細胞周期ライフサイクル時間スケールにマッピングすることにより、反復または回復時間または細胞周期期間が同一でない実験の間で、フェーズ固有の直接比較を行うことができます8、14、15。
同期された母集団は時系列14、15、16、17の過程である程度の割合で同期を失うため、同期損失率の変動性も実験間の定量的比較を妨げる可能性があります。CLOCCSは、母集団の位置とその分布の分散を特定することにより、同期損失率の違いを説明します。この強力なツールは、実験間の具体的かつ詳細な比較を可能にするため、反復間だけでなく、環境条件、変異体、さらには細胞周期のタイミングが劇的に異なる種間でも関連する比較を直接行うことができます14,15。
この論文では、CLOCCSを使用して、同期/リリース時系列実験からのデータをフィッティングすることによってパラメータを推定し、データを共通のライフラインスケールにマッピングし、反復または実験間の関連する比較を行う方法について説明します。ライフラインアライメントにより、これらの実験間でフェーズ特異的な直接比較が可能になり、反復の集約と比較が可能になり、異なる回復タイミングと細胞周期期間を持つ実験間でより関連性の高い比較を行うことができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、同期した細胞集団に関する時系列実験のデータをより正確かつ定量的に評価する方法を提示する。この方法は、出芽データやフローサイトメトリーDNA含量データなどの入力細胞周期相データを使用するベイズ推論モデルであるCLOCCSから学習したパラメータを利用して、各実験をパラメータ化します14,15。CLOCCSは、入力された細胞周期フ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. CampioneとS. Haaseは、米国国立科学財団(DMS-1839288)と米国国立衛生研究所(5R01GM126555)からの資金提供を受けて支援されました。さらに、著者らは、原稿へのコメントとプロトコルのベータテストについて、Huarui Zhou(デューク大学)に感謝したいと思います。また、Java コードに協力してくれた Francis Motta 氏 (フロリダ・アトランティック大学) と Joshua Robinson氏にも感謝します。
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
Riferimenti
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