Выравнивание синхронизированных данных временных рядов с использованием характеризирующей модели синхронизации клеточного цикла для перекрестных сравнений
Summary
Одна из проблем анализа синхронизированных экспериментов с временными рядами заключается в том, что эксперименты часто различаются по продолжительности восстановления после синхронности и периоду клеточного цикла. Таким образом, измерения из разных экспериментов не могут быть проанализированы в совокупности или легко сравниваться. Здесь мы описываем метод выравнивания экспериментов, позволяющий проводить фазовые сравнения.
Abstract
Исследование клеточного цикла часто зависит от синхронизации клеточных популяций для измерения различных параметров во временном ряду, когда клетки пересекают клеточный цикл. Однако даже в аналогичных условиях повторные эксперименты демонстрируют различия во времени, необходимом для восстановления после синхронности и прохождения клеточного цикла, что предотвращает прямые сравнения в каждый момент времени. Проблема сравнения динамических измерений в экспериментах усугубляется в мутантных популяциях или в альтернативных условиях роста, которые влияют на время восстановления синхронности и/или период клеточного цикла.
Ранее мы опубликовали параметрическую математическую модель под названием «Характеристика потери синхронизации клеточного цикла» (CLOCCS), которая отслеживает, как синхронные популяции клеток высвобождаются из синхронности и прогрессируют в клеточном цикле. Полученные параметры из модели затем могут быть использованы для преобразования экспериментальных точек времени из синхронизированных экспериментов с временными рядами в нормализованную шкалу времени (точки линии жизни). Вместо того, чтобы представлять время, прошедшее в минутах от начала эксперимента, шкала линии жизни представляет собой прогрессию от синхронности до входа в клеточный цикл, а затем через фазы клеточного цикла. Поскольку точки линии жизни соответствуют фазе средней клетки в синхронизированной популяции, эта нормализованная временная шкала позволяет проводить прямые сравнения между экспериментами, в том числе с различными периодами и временем восстановления. Кроме того, модель использовалась для согласования экспериментов по клеточному циклу между различными видами (например, Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe), что позволяет проводить прямое сравнение измерений клеточного цикла, что может выявить эволюционные сходства и различия.
Introduction
Измерения временных рядов, выполненные на синхронизированных популяциях клеток по мере их продвижения по клеточному циклу, являются стандартным методом исследования механизмов, контролирующих прогрессию клеточного цикла 1,2,3,4,5,6,7,8 . Возможность проводить сравнения между экспериментами по синхронизации/выпуску временных рядов жизненно важна для нашего понимания этих динамических процессов. Использование повторных экспериментов для подтверждения результатов может повысить уверенность в воспроизводимости выводов. Кроме того, сравнения между условиями окружающей среды, между мутантами и даже между видами могут раскрыть много новых идей о регуляции клеточного цикла. Однако межэкспериментальная вариабельность восстановления после синхронности и скорости прогрессирования клеточного цикла ухудшает способность проводить сравнения от момента времени к моменту времени между репликами или между экспериментами с измененным временем клеточного цикла. Из-за этих проблем реплики часто не включаются в полные временные ряды (например, Spellman et al.4). Когда собираются реплики для всех временных рядов, данные не могут быть проанализированы в совокупности, а для анализа используется одна реплика, а другие реплики часто сводятся к дополнительным цифрам (например, Orlando et al.8). Кроме того, трудно сравнивать эксперименты с различными характеристиками восстановления или прогрессирования клеточного цикла. Измерения меньших интервалов между интересующим событием и ориентиром клеточного цикла (например, появлением почек, вступлением в S-фазу или началом анафазы) могут помочь уменьшить количество ошибок, если эти знаковые события отслеживаются 1,2,3,9,10,11,12. Однако тонкие, но важные различия могут остаться незамеченными или скрытыми при использовании этих специальных методов. Наконец, одноклеточный анализ позволяет анализировать прогрессирование клеточного цикла, не полагаясь на синхронизацию или выравнивание13, хотя крупномасштабные измерения в одноклеточных исследованиях могут быть сложными и дорогостоящими.
Чтобы преодолеть эти трудности, мы разработали модель «Характеристика потери синхронизации клеточного цикла» (CLOCCS), чтобы помочь в анализе измерений временных рядов, сделанных на синхронизированных популяциях14,15. CLOCCS — это гибкая математическая модель, которая описывает распределение синхронизированных клеток по фазам клеточного цикла по мере того, как они освобождаются от синхронности и продвигаются по клеточному циклу. Структура процесса ветвления позволяет модели учитывать асимметричные качества материнских и дочерних клеток после деления, как это наблюдается у S. cerevisiae, но при этом по-прежнему полезна для организмов, которые делятся путем деления, таких как S. pombe. Модель может принимать входные данные из различных типов измерений для определения фазы клеточного цикла. Он может принимать данные фазы почкования, которые включают измерения процента отпочковавшихся клеток с течением времени, что позволяет оценить количество клеток за пределами фазы G114,15. Модель также может принимать проточные цитометрические данные, которые измеряют содержание ДНК, что позволяет оценить ориентировочные переходы от G1 к S, от S к G2 и от M к G115. Флуоресцентные морфологические маркеры также могут быть использованы для идентификации фазы клеточного цикла. Флуоресцентная маркировка миозиновых колец, ядер и тел веретенообразных полюсов (SPB) может быть использована для определения фазы клеточного цикла, и они были включены в модельCLOCCS 11; Однако эти измерения не будут описаны в этом протоколе. Кроме того, индекс септации использовался в качестве входных данных для моделирования данных из S. pombe14. Таким образом, модель может быть использована для анализа клеточного цикла в различных организмах и может быть дополнительно расширена.
CLOCCS – это параметрическая модель, которая позволяет сделать полный байесовский вывод о нескольких параметрах из входных данных (например, процент почкования, содержание ДНК). Эти параметры включают время восстановления после синхронии, продолжительность периода клеточного цикла (оценивается отдельно для материнских и дочерних клеток) и среднее положение клеток в клеточном цикле в каждый момент времени. Эти параметры представляют собой поведение средней клетки в популяции, что позволяет исследователю сопоставлять каждую временную точку с положением клеточного цикла, выраженным в виде точки спасательного круга. Преобразование в точки линии жизни зависит от параметров CLOCCS лямбда (λ) и mu0 (μ0)14,15. Параметр λ соответствует среднему периоду клеточного цикла материнских клеток. Однако из-за задержки мать-дочь14,15 это не средний период клеточного цикла всей популяции, включающий как материнские, так и дочерние клетки. CLOCCS дополнительно выводит параметр дельта (δ), который соответствует задержке матери и дочери и, таким образом, позволяет рассчитать средний период клеточного цикла всей популяции. Наконец, поскольку каждый эксперимент начинается после освобождения от синхронизации клеточного цикла, время, необходимое для восстановления после метода синхронизации, представлено параметром CLOCCS μ0. CLOCCS подгоняет модель под входные данные о фазе клеточного цикла, а затем выводит эти параметры с помощью алгоритма Монте-Карло со случайным блужданием цепи Маркова14,15. Сопоставляя несколько экспериментов с общей шкалой времени жизненного цикла клетки, можно проводить прямые фазовые сравнения между репликами или экспериментами, в которых время восстановления или периоды клеточного цикла не идентичны 8,14,15.
Поскольку синхронизированные популяции теряют синхронность с некоторой скоростью в течение временных рядов14,15,16,17, изменчивость скорости потери синхронности также может препятствовать количественным сравнениям между экспериментами. Определяя местоположение популяций и дисперсию в их распределении, CLOCCS учитывает различия в показателях потери синхронности. Этот мощный инструмент позволяет проводить конкретные и подробные сравнения между экспериментами, тем самым предоставляя возможность напрямую проводить релевантные сравнения не только между репликами, но и между условиями окружающей среды, мутантами и даже видами, которые имеют совершенно разные сроки клеточного цикла14,15.
В этой статье описывается метод, использующий CLOCCS для оценки параметров путем подгонки данных из экспериментов с синхронными временными рядами / выпуском, сопоставления данных с общей шкалой жизненного цикла, а затем проведения соответствующих сравнений между репликами или экспериментами. Выравнивание линии жизни позволяет проводить прямые фазовые сравнения в этих экспериментах, что позволяет агрегировать и сравнивать репликации, а также проводить более релевантные сравнения между экспериментами с разными сроками восстановления и периодами клеточного цикла.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе представлен метод более точной и количественной оценки данных экспериментов временных рядов на синхронизированных популяциях клеток. Метод использует изученные параметры из CLOCCS, байесовской модели вывода, которая использует входные данные о фазе клеточного цикла, та?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
С. Кампионе и С. Хаазе были поддержаны финансированием Национального научного фонда (DMS-1839288) и Национальных институтов здравоохранения (5R01GM126555). Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Хуаруи Чжоу (Huarui Zhou) из Университета Дьюка за комментарии к рукописи и за бета-тестирование протокола. Мы также благодарим Фрэнсиса Мотту (Francis Motta) из Атлантического университета Флориды (Florida Atlantic University) и Джошуа Робинсона (Joshua Robinson) за помощь в работе с кодом Java.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
Riferimenti
- Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
- Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
- Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
- Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
- Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
- Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
- Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
- Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
- Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
- Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
- Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
- Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
- Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
- Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
- Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
- Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
- Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
- Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
- Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
- Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
- Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
- Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
- Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).
