Anpassning av synkroniserade tidsseriedata med hjälp av den karakteristiska synkroniseringsmodellen för förlust av cellcykel för jämförelser mellan experiment
Summary
En utmaning med att analysera synkroniserade tidsserieexperiment är att experimenten ofta skiljer sig åt i längden på återhämtningen från synkronisering och cellcykelperioden. Således kan mätningarna från olika experiment inte analyseras aggregerat eller enkelt jämföras. Här beskriver vi en metod för att anpassa experiment för att möjliggöra fasspecifika jämförelser.
Abstract
Att undersöka cellcykeln beror ofta på att synkronisera cellpopulationer för att mäta olika parametrar i en tidsserie när cellerna passerar cellcykeln. Men även under liknande förhållanden visar replikatexperiment skillnader i den tid som krävs för att återhämta sig från synkronisering och att korsa cellcykeln, vilket förhindrar direkta jämförelser vid varje tidpunkt. Problemet med att jämföra dynamiska mätningar mellan experiment förvärras i mutanta populationer eller i alternativa tillväxtförhållanden som påverkar den synkrona återhämtningstiden och / eller cellcykelperioden.
Vi har tidigare publicerat en parametrisk matematisk modell som heter Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) som övervakar hur synkrona populationer av celler frigörs från synkronisering och fortskrider genom cellcykeln. De inlärda parametrarna från modellen kan sedan användas för att konvertera experimentella tidpunkter från synkroniserade tidsserieexperiment till en normaliserad tidsskala (livlinjepunkter). I stället för att representera den förflutna tiden i minuter från experimentets början representerar livlinjeskalan progressionen från synkronisering till cellcykelinträde och sedan genom cellcykelns faser. Eftersom livlinjepunkter motsvarar fasen för den genomsnittliga cellen inom den synkroniserade populationen, möjliggör denna normaliserade tidsskala direkta jämförelser mellan experiment, inklusive de med varierande perioder och återhämtningstider. Dessutom har modellen använts för att anpassa cellcykelexperiment mellan olika arter (t.ex. Saccharomyces cerevisiae och Schizosaccharomyces pombe), vilket möjliggör direkt jämförelse av cellcykelmätningar, vilket kan avslöja evolutionära likheter och skillnader.
Introduction
Tidsseriemätningar gjorda på synkroniserade populationer av celler när de fortskrider genom cellcykeln är en standardmetod för att undersöka mekanismerna som styr cellcykelprogression 1,2,3,4,5,6,7,8 . Möjligheten att göra jämförelser mellan synkroniserings-/lanseringstidsserieexperiment är avgörande för vår förståelse av dessa dynamiska processer. Användningen av upprepade experiment för att bekräfta resultaten kan öka förtroendet för slutsatsernas reproducerbarhet. Dessutom kan jämförelser mellan miljöförhållanden, mellan mutanter och till och med mellan arter avslöja många nya insikter i cellcykelreglering. Interexperimentell variabilitet i återhämtningen från synkronisering och i hastigheten på cellcykelprogressionen försämrar emellertid möjligheten att göra jämförelser mellan replikat eller mellan experiment med förändrad cellcykeltiming. På grund av dessa utmaningar inkluderas replikat ofta inte för hela tidsserien (t.ex. Spellman et al.4). När replikat för hela tidsserien samlas in kan data inte analyseras aggregerat, utan snarare används ett enda replikat för analys, och andra replikat förvisas ofta till kompletterande siffror (t.ex. Orlando et al.8). Dessutom är jämförelser mellan experiment med olika återhämtnings- eller cellcykelprogressionsegenskaper svåra. Mätningarna av mindre intervall mellan en händelse av intresse och ett landmärke i cellcykeln (t.ex. knoppuppkomst, S-fasinträde eller anafasstart) kan bidra till att minska fel om dessa landmärkehändelser spåras 1,2,3,9,10,11,12. Subtila men viktiga skillnader kan dock förbli oupptäckta eller dolda med hjälp av dessa ad hoc-metoder. Slutligen möjliggör encellsanalyser analys av cellcykelprogression utan att förlita sig på synkronisering eller anpassning13, även om storskaliga mätningar i encellsstudier kan vara utmanande och kostsamma.
För att övervinna dessa svårigheter utvecklade vi modellen Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) för att underlätta analysen av tidsseriemätningar gjorda på synkroniserade populationer14,15. CLOCCS är en flexibel matematisk modell som beskriver fördelningen av synkroniserade celler över cellcykelfaser när de frigörs från synkronisering och framsteg genom cellcykeln. Förgreningsprocessramen gör det möjligt för modellen att redogöra för de asymmetriska egenskaperna hos moder- och dotterceller efter delning, som observerats i S. cerevisiae, samtidigt som den fortfarande är användbar för organismer som delar sig genom fission, såsom S. pombe. Modellen kan ta indata från en mängd olika mättyper för att specificera cellcykelfasen. Det kan inta spirande cellcykelfasdata, vilket inkluderar mätningar av procentandelen knoppade celler över tiden, vilket möjliggör uppskattning av antalet celler utanför den unbudded G1-fasen14,15. Modellen kan också ta in flödescytometriska data som mäter DNA-innehållet, vilket möjliggör bedömning av landmärkeövergångar från G1 till S, S till G2 och M till G115. Fluorescerande morfologiska markörer kan också användas för att identifiera cellcykelfasen. Den fluorescerande märkningen av myosinringar, kärnor och spindelpolkroppar (SPB) kan användas för att bestämma cellcykelfasen, och dessa införlivades i CLOCCS-modell11; Dessa mätningar kommer dock inte att beskrivas i detta protokoll. Dessutom användes septationsindexet som indata för modellering av data från S. pombe14. Således kan modellen användas för cellcykelanalyser i en mängd olika organismer och kan utvidgas ytterligare.
CLOCCS är en parametrisk modell som möjliggör fullständig Bayesiansk inferens av flera parametrar från indata (t.ex. spirande procent, DNA-innehåll). Dessa parametrar inkluderar återhämtningstiden från synkronisering, cellcykelperiodens längd (uppskattad separat för moder- och dotterceller) och cellens genomsnittliga cellcykelposition vid varje tidpunkt. Dessa parametrar representerar beteendet hos den genomsnittliga cellen i befolkningen, vilket gör det möjligt för forskaren att kartlägga varje tidspunkt till en cellcykelposition uttryckt som en livlinjepunkt. Omvandlingen till livlinepunkter beror på CLOCCS-parametrarna lambda (λ) och mu0 (μ0)14,15. Parametern λ motsvarar den genomsnittliga cellcykelperioden för modercellerna. På grund av mor-dotter-fördröjningen14,15 är detta dock inte den genomsnittliga cellcykelperioden för hela befolkningen som inkluderar både moder- och dottercellerna. CLOCCS härleder dessutom parametern delta (δ), vilket motsvarar mor-dotter-fördröjningen och möjliggör därmed beräkning av den genomsnittliga cellcykelperioden för hela populationen. Slutligen, eftersom varje experiment börjar efter frisläppning från cellcykelsynkronisering, representeras den tid som krävs för att återställa från synkroniseringsmetoden av CLOCCS-parametern μ0. CLOCCS anpassar en modell till ingångscellcykelfasdata och härleder sedan dessa parametrar med hjälp av en slumpmässig promenad Markov-kedja Monte Carlo-algoritm14,15. Genom att kartlägga flera experiment till en gemensam cellcykellivstidsskala kan direkta fasspecifika jämförelser göras mellan replikat eller experiment där återhämtningstiden eller cellcykelperioderna inte är identiska 8,14,15.
Eftersom synkroniserade populationer förlorar synkronisering i viss takt under tidsserien14,15,16,17 kan variabilitet i synkroniseringsförlusthastigheten också hindra kvantitativa jämförelser mellan experiment. Genom att identifiera populationernas plats och variansen i deras fördelningar tar CLOCCS hänsyn till skillnader i graden av synkroniseringsförlust. Detta kraftfulla verktyg möjliggör specifika och detaljerade jämförelser mellan experiment, vilket ger möjlighet att direkt göra relevanta jämförelser inte bara mellan replikat utan också mellan miljöförhållanden, mutanter och till och med arter som har dramatiskt olika cellcykeltider14,15.
Detta dokument beskriver en metod som använder CLOCCS för att uppskatta parametrar genom att anpassa data från synkroniserings-/frisläppningstidsserieexperiment, mappa data till en gemensam livlinjeskala och sedan göra relevanta jämförelser mellan replikat eller experiment. Livlinaanpassning möjliggör direkta fasspecifika jämförelser mellan dessa experiment, vilket möjliggör aggregering och jämförelse av replikat och för att göra mer relevanta jämförelser mellan experiment med olika återhämtningstider och cellcykelperioder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna artikel presenterar en metod för att mer exakt och kvantitativt utvärdera data från tidsserieexperiment på synkroniserade populationer av celler. Metoden använder inlärda parametrar från CLOCCS, en Bayesiansk inferensmodell som använder inmatade cellcykelfasdata, såsom spirande data och flödescytometrisk DNA-innehållsdata, för att parametrisera varje experiment14,15. CLOCCS använder indata från cellcykeln för att härleda parametrarna för va…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione och S. Haase fick stöd av finansiering från National Science Foundation (DMS-1839288) och National Institutes of Health (5R01GM126555). Dessutom vill författarna tacka Huarui Zhou (Duke University) för kommentarer om manuskriptet och för betatestning av protokollet. Vi tackar också Francis Motta (Florida Atlantic University) och Joshua Robinson för deras hjälp med Java-koden.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
Riferimenti
- Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
- Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
- Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
- Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
- Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
- Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
- Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
- Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
- Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
- Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
- Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
- Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
- Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
- Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
- Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
- Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
- Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
- Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
- Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
- Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
- Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
- Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
- Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).
