Produzione di celle su larga scala basata su microcarrier porosi solubili di grado GMP

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere la produzione su larga scala di cellule aderenti attraverso un sistema completamente chiuso basato su microcarrier solubili di grado GMP. La coltivazione di cellule staminali mesenchimali umane, cellule HEK293T e cellule Vero è stata convalidata e ha soddisfatto sia le richieste di quantità che i criteri di qualità per l'industria della terapia cellulare e genica.

Abstract

I ricercatori nel settore della terapia cellulare e genica (CGT) hanno affrontato a lungo una sfida formidabile nell'espansione efficiente e su larga scala delle cellule. Per affrontare le principali carenze del sistema di coltura planare bidimensionale (2D), abbiamo sviluppato in modo innovativo una piattaforma automatizzata di produzione di celle su scala industriale chiusa (ACISCP) basata su un microcarrier poroso e solubile di grado GMP per la coltura 3D di cellule aderenti, comprese le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC), le cellule HEK293T e le cellule Vero. Per ottenere un'espansione su larga scala, è stata condotta un'espansione a due stadi con bioreattori a serbatoio agitato da 5 L e 15 L per produrre 1,1 x 10¹⁰ hMSC con un'espansione complessiva di 128 volte in 9 giorni. Le cellule sono state raccolte dissolvendo completamente i microcarrier, concentrate, lavate e formulate con un sistema di elaborazione cellulare basato su centrifuga a flusso continuo, e quindi aliquotate con un sistema di riempimento cellulare. Rispetto alla coltura planare 2D, non ci sono differenze significative nella qualità delle hMSC raccolte dalla coltura 3D. Abbiamo anche applicato questi microcarrier porosi solubili ad altri tipi di cellule popolari nel settore CGT; in particolare, le cellule HEK293T e le cellule Vero sono state coltivate per raggiungere densità cellulari di picco rispettivamente di 1,68 x 10 7 cellule/mL e 1,08 x 10⁷ cellule/mL. Questo studio fornisce un protocollo per l'utilizzo di una piattaforma di ingegneria dei bioprocessi che sfrutta le caratteristiche dei microcarrier solubili di grado GMP e delle apparecchiature chiuse avanzate per ottenere la produzione su scala industriale di cellule aderenti.

Introduzione

L'industria CGT ha assistito a un'espansione esponenziale negli ultimi due decenni. Si prevede che l'evoluzione dei farmaci di nuova generazione tratterà e curerà numerose malattie refrattarie¹. Dalla prima approvazione da parte della Food and Drug Administration (FDA) di un prodotto CGT, Kymriah, nel 2017, la ricerca e lo sviluppo relativi alla CGT nel mondo hanno continuato a crescere a un ritmo rapido, con la FDA che ha visto aumentare a 500 le domande di nuovi farmaci sperimentali attivi per CGT nel 2018². Era stato previsto che il numero di approvazioni dei prodotti CGT sarebbe stato probabilmente di 54-74 negli Sta....

Protocollo

Il cordone ombelicale umano è stato ottenuto dall'ospedale Tsinghua Changgeng di Pechino. Tutte le procedure e i protocolli relativi all'acquisizione, all'isolamento e alla coltura di cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (UCMSC) sono stati condotti con il consenso informato e con l'approvazione del Comitato Etico dell'Ospedale Tsinghua Changgeng di Pechino (numero di deposito 22035-4-02), e le procedure e i protocolli sono conformi alla dichiarazione di Helsinki del 1964 e ai suoi successivi emendamenti o a standard etici comparabili.

1. Coltura monostrato di hMSC, cellule HEK293T e cellule Vero

Risultati

La piattaforma ACISCP è un sistema completamente chiuso che impiega una serie di bioreattori a serbatoio agitato per l'espansione dello scale-up, un sistema di elaborazione cellulare per la raccolta e la formulazione automatizzata delle cellule e un sistema di riempimento delle cellule (Figura 1). Le cellule aderenti si attaccano ai microcarrier porosi, che possono essere dispersi nel bioreattore, ottenendo così la coltivazione in sospensione delle cellule aderenti.

Discussione

Sia l'immunoterapia che la terapia con cellule staminali utilizzano cellule vive come farmaci; Tuttavia, i loro prodotti finali non devono essere purificati o sterilizzati allo stesso modo delle piccole molecole o dei virus. Pertanto, il principio della Quality by Design (QbD) dovrebbe essere sempre tenuto presente e applicato praticamente al processo di produzione e controllo chimico (CMC) durante la produzione di celle²³. Un sistema di coltura a cellule completamente chiuso, nonché un sistema di.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina EDTA	BasalMedia	S310JV	Utilizzato per la raccolta di cellule 2D.
3D FloTrix Digest	CytoNiche Biotech	R001-500	Si tratta di un reagente che dissolve specificamente i microcarrier 3D TableTrix.
3D FloTrix MSC Terreno senza siero	CytoNiche Biotech	RMZ112	Questo è un terreno privo di siero e di origine animale per l'espansione e il mantenimento delle cellule staminali mesenchimali in coltura planare 2D e coltura 3D su microcarrier 3D TableTrix.
Modulo di filtrazione monouso 3D FloTrix	CytoNiche Biotech	R020-00-10	Questo modulo contiene 0,22 μ M Capsule filtranti utilizzate per la filtrazione del terreno di coltura e della soluzione digestiva.
3D FloTrix Custodia Monouso (10 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-03	Utilizzato come sacca di alimentazione per bioreattore da 5 L.
Sacca di stoccaggio monouso 3D FloTrix (3 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-01	Utilizzata come sacca per la semina o il trasferimento di cellule.
Sacca di stoccaggio monouso 3D FloTrix (50 L)	CytoNiche Biotech	R020-00-04	Utilizzata come sacca di alimentazione per bioreattore da 15 L.
3D FloTrix vivaPACK Riempimento monouso Kit di materiali di consumo per finitura	CytoNiche Biotech	PACK-01-01	Si tratta di un kit standard adattato al sistema di riempimento e finitura 3D vivaPACK.
Sistema di riempimento e finitura 3D FloTrix vivaPACK per cellule	CytoNiche Biotech	vivaPACK	Questo sistema è un dispositivo chiuso per la gestione dei liquidi, con funzioni automatizzate di miscelazione ed esaurimento dei gas. Le cellule risospese nel tampone di crioconservazione possono essere aliquotate rapidamente e uniformemente in 20 sacche per lotto.
Sistema di elaborazione cellulare 3D FloTrix vivaPREP PLUS	CytoNiche Biotech	vivaPREP PLUS	Questo sistema è un dispositivo basato su centrifuga a flusso continuo. Le cellule possono essere concentrate, lavate e risospese con procedure completamente chiuse.
Kit monouso per l'elaborazione cellulare 3D FloTrix vivaPREP PLUS	CytoNiche Biotech	PREP-PLUS-00	Si tratta di un kit standard adattato all'elaborazione cellulare 3D vivaPREP PLUS.
Bioreattore 3D FloTrix vivaSPIN  15 L	CytoNiche Biotech	FTVS15	Questo prodotto bioreattore utilizza un controller, un recipiente con serbatoio agitato in vetro da 15 L e valutatori. È disponibile uno speciale tubo di perfusione.
Bioreattore 3D FloTrix vivaSPIN  5 L	CytoNiche Biotech	FTVS05	Questo bioreattore utilizza un controller, un recipiente con serbatoio agitato in vetro da 5 L e assessori. È disponibile uno speciale tubo di perfusione.
Pacchetto di materiali di consumo 3D FloTrix vivaSPIN Closed System (10/15 L)	CytoNiche Biotech	R020-10-10	Si tratta di un kit di tubi standard adattato al bioreattore 3D vivaSPIN 15 L, contenente sacche di campionamento.
Pacchetto di materiali di consumo 3D FloTrix vivaSPIN Closed System (2/5 L)	CytoNiche Biotech	R020-05-10	Si tratta di un kit di tubi standard adattato al bioreattore 3D vivaSPIN da 5 L, contenente sacche di campionamento.
Microcarrier 3D TableTrix G02	CytoNiche Biotech	G02-10-10g	Questi microcarrier porosi e degradabili sono adatti per HEK293T colture cellulari. Vengono forniti pre-sterilizzati in 10 g/flacone con tubi C-Flex per la saldatura ai tubi dei bioreattori.
Microcarrier 3D TableTrix V01	CytoNiche Biotech	V01-100-10g	Questi microcarrier porosi e degradabili sono adatti per colture cellulari aderenti, si presentano come microcarrier non sterilizzati che devono essere sterilizzati in autoclave in PBS prima dell'uso. Sono particolarmente adatti per la produzione di vaccini.
3D TableTrix microcarrier W01	CytoNiche Biotech	W01-10-10g (confezione monouso); W01-200 (compresse)	Questi microcarrier porosi e degradabili sono adatti per colture cellulari aderenti, in particolare per le cellule che devono essere raccolte come prodotti finali. Vengono forniti pre-sterilizzati in 10 g/flacone con tubi C-Flex per la saldatura ai tubi dei bioreattori. Il prodotto ha ottenuto 2 qualifiche per eccipienti farmaceutici da CDE, con i numeri di registrazione di [F20200000496; F20210000003]. Ha anche ricevuto la qualifica DMF per gli eccipienti farmaceutici dalla FDA, con il numero di registrazione di [DMF:35481]
APC anticorpo CD45	BioLegend		368512 Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità MSC
doppia colorazione Calcein-AM/PI Dojindo		C542	Il kit di doppia colorazione Calcein-AM/PI viene utilizzato per la colorazione a fluorescenza simultanea di cellule vitali e morte. Questo kit contiene soluzioni di calceina-AM e ioduro di propidio (PI), che colorano rispettivamente le cellule vitali e quelle morte.
Tappo per chiusure per contenitori EZ Top per contenitori NALGENE (500mL)	Saint-Gobain	CAP-38	Le marche e i numeri di catalogo sono solo ad esempio, prodotti simili sono disponibili da vari fornitori e purché abbiano la stessa funzionalità, gli articoli potrebbero essere sostituiti con altre marche.
Tubi C-Flex, formulazione 374 (0,25 pollici x 0,44 pollici)	Saint-Gobain	374-250-3	Utilizzato per la saldatura e la disconnessione di tubi.
CryoMACS Sacca di Congelamento 50	Miltenyi Biotec	200-074-400	Utilizzato per espandere il 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill& Finisci il kit di consumabili.
Dimetilsolfato (DMSO)	Sigma	D2650-100mL	Utilizzato per la preparazione di soluzioni di crioconservazione.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	BasalMedia	L120KJ	Utilizzato per la coltivazione di cellule HEK293T e Vero.
DURAN Original GL 45 Flacone da laboratorio (2 L)	DWK life sciences	218016357	Utilizzato per la raccolta dei rifiuti dal bioreattore da 5 L.
DURAN Original GL 45 Flacone da laboratorio (5 L)	DWK life sciences	218017353	Utilizzato per la raccolta dei rifiuti dal bioreattore da 15 L.
DURAN Original GL 45 Flacone da laboratorio (500 mL)	DWK life sciences	218014459	Utilizzato per il flacone supplementare di NaOH 0,1 M.
Chiusure per contenitori EZ Top per contenitori NALGENE (500mL)	Saint-Gobain	EZ500 ML-38-2	Le marche e i numeri di catalogo sono solo ad esempio, prodotti simili sono disponibili da vari fornitori e purché abbiano la stessa funzionalità, gli articoli potrebbero essere sostituiti con altre marche.
Siero fetale bovino (FBS) di qualità superiore	Wisent	086-150	Utilizzato per la coltivazione di cellule HEK293T.
Anticorpo CD14 umano FITC	BioLegend	301804	Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
Anticorpo CD34 umano FITC	BioLegend	343504	Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
FITC anti-umano CD90 (Thy1) Antibody	BioLegend	328108	Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
Citometria a flusso	Beckman Coulter	CytoFLEX	Utilizzato per la valutazione dell'identità cellulare.
Analizzatore cellulare a fluorescenza	Alit life science	Countstar Rigel S2	Utilizzato per il conteggio cellulare. La vitalità cellulare può essere calcolata colorando con coloranti AO/PI.
Tappo a vite per connettore multiporta GL 45 con 2 porte	marchi e i	di DWK life sciences	292632806 sono solo ad esempio, prodotti simili sono disponibili da vari fornitori e, purché abbiano le stesse funzionalità, gli articoli potrebbero essere sostituiti con altri marchi.
Glucometro	Sinocare 6243578		Utilizzato per rilevare la concentrazione di glucosio nel terreno di coltura cellulare e nel surnatante.
La soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), con calcio e magnesio	Gibco	14025092	utilizzata per la preparazione della soluzione digestiva.
Albumina umana 20% Behring (HSA)	CSL Behring	N/A	Utilizzato per la preparazione del tampone di lavaggio.
Microscopio a fluorescenza invertita	OLYMBUS	Utilizzato per l'osservazione e l'imaging a fluorescenza e a campo brifgt.
Cilindro graduato Nalgene (500 mL)	Thermo Scientific	3662-0500PK	Utilizzato per calibrare la velocità del volume di movimentazione dei liquidi delle pompe peristaltiche.
Siero di vitello neonato (NBS) superfino	MINHAI BIO	SC101.02	Utilizzato per la coltivazione di cellule Vero.
Kit di differenziazione e caratterizzazione adipogenica delle cellule staminali mesenchimali umane	OriCell Cyagen	HUXUC-90031	Utilizzato per la differenziazione tri-lineage delle hUCMSCs.
Kit di differenziazione e caratterizzazione condrogenica delle cellule staminali mesenchimali umane	OriCell Cyagen	HUXUC-90041	Utilizzato per la differenziazione tri-lineage delle hUCMSCs.
Kit di differenziazione e caratterizzazione osteogenica delle cellule staminali mesenchimali umane	OriCell Cyagen	HUXUC-90021	Utilizzato per la differenziazione tri-lineage di hUCMSCs.
PE anti-umano CD105 Anticorpo	BioLegend	800504	Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
PE anti-umano CD19 Anticorpo	BioLegend	302208	Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
PE anti-umano CD73 (Ecto-5'-nucleotidasi) Anticorpo	BioLegend	344004	Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
PE anti-umano HLA-DR Anticorpo	BioLegend	307605	Utilizzato nella citometria a flusso per la valutazione dell'identità delle MSC.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Wisent	311-010-CL	Utilizzato nella sterilizzazione in autoclave di recipienti in vetro e microcarrier V01 e nella sostituzione di terreni di coltura.
Tubi in silicone sanitario polimerizzato al platino Sani-Tech (0,13 pollici x 0,25 pollici)	Saint-Gobain	ULTRA-C-125-2F	Utilizzato per il trasferimento di soluzioni azionato da pompe peristaltiche.
Soluzione salina sterile	Hopebiol	HBPP008-500	Utilizzato per la preparazione del tampone di lavaggio.
Tripzima Ricombinante Tripsina	BasalMedia	S342JV	Questo reagente viene utilizzato per il trasferimento da microsfera a perlina di cellule HEK293T e Vero.
Sigillante per tubi	Yingqi Biotech	Sigillante per tubi I	Questo sigillante è compatibile sia con i tubi C-Flex che con i tubi in PVC.
Saldatrice per tubi in PVC	Chu Biotech	Tube Welder Micro I	Utilizzato per la saldatura di tubi in PVC.
Saldatrice per tubi in TPE	Yingqi Biotech	Saldatrice per tubi I-V2	Utilizzata per la saldatura di tubi in TPE.
ViaStain AO / PI Viability Stains	Nexcelom	CS2-0106-25mL	Dual-Fluorescence Viability, utilizzando l'arancio acridina (AO) e lo ioduro di propidio (PI), è il metodo raccomandato per un'analisi accurata della vitalità delle cellule primarie, come le PBMC, e delle cellule staminali in campioni contenenti detriti.

umano Kit di I numeri di catalogo CKX53SF