Beskrevet her er en simpel arbejdsgang til at differentiere endotelceller fra humane pluripotente stamceller efterfulgt af en detaljeret protokol for deres mekaniske stimulering. Dette giver mulighed for undersøgelse af endotelcellernes udviklingsmekanobiologi. Denne fremgangsmåde er kompatibel med downstream-analyser af levende celler indsamlet fra kulturchippen efter mekanisk stimulering.
Hjertet er det første organ, der funktionelt etableres under udviklingen, hvilket initierer blodcirkulationen meget tidligt i svangerskabet. Udover at transportere ilt og næringsstoffer for at sikre fostervækst, styrer fostercirkulationen mange afgørende udviklingsbegivenheder, der finder sted i endotellaget gennem mekaniske signaler. Biomekaniske signaler inducerer strukturelle ændringer i blodkarrene, etablerer arteriovenøs specifikation og styrer udviklingen af hæmatopoietiske stamceller. Utilgængeligheden af de udviklende væv begrænser forståelsen af cirkulationens rolle i tidlig menneskelig udvikling; Derfor er in vitro-modeller centrale værktøjer til undersøgelse af karmekanobiologi. Dette papir beskriver en protokol til differentiering af endotelceller fra humane inducerede pluripotente stamceller og deres efterfølgende såning i en fluidisk enhed for at studere deres reaktion på mekaniske signaler. Denne fremgangsmåde muliggør langsigtet dyrkning af endotelceller under mekanisk stimulering efterfulgt af hentning af endotelcellerne til fænotypisk og funktionel karakterisering. In vitro-modellen , der er etableret her, vil være medvirkende til at belyse de intracellulære molekylære mekanismer, der transducerer signaleringen medieret af mekaniske signaler, som i sidste ende orkestrerer karudvikling under menneskets fosterliv.
Under embryonal udvikling er hjertet det første organ, der etablerer funktionalitet1 med påviselige sammentrækninger fra det tidligste stadium af endokardierørdannelse2. Cirkulation, sammen med de mekaniske signaler medieret af blodstrømmen i karret, styrer mange afgørende aspekter af tidlig udvikling. Før fostrets cirkulationsetablering er vaskulaturen organiseret i en primær kapillær plexus; Efter hjertefunktion omorganiseres denne plexus til venøs og arteriel vaskulatur3. Mekaniske signalers rolle i arteriovenøs specifikation afspejles af den panendotelekspression af arterielle og venøse markører før initiering af blodgennemstrømning4.
Hemodynamiske kræfter styrer ikke kun udviklingen af selve vaskulaturen, men spiller også en grundlæggende rolle i kontrollen af blodcelledannelsen. Hæmatopoietiske stam- og stamceller (HSPC’er) stammer fra specialiserede endotelceller kaldet hæmogent endotel 5,6,7,8, der udelukkende findes i forskellige anatomiske regioner af embryonerne i det tidlige udviklingsstadium. Hjerte-mangelfulde modeller, sammen med in vitro modeller, har vist, at mekaniske signaler instruerer og øger HSPC produktion fra det hæmogene endotel 9,10,11,12,13,14.
Forskellige typer strømningsdynamik har vist sig at differentiere kontrol af cellecyklus15, kendt for at være vigtig i både hæmogent endotel 16,17 og arteriel cellespecifikation18. Alt i alt er mekaniske signaler kritiske determinanter for celleidentitet og funktion under udvikling. Nye in vitro fluidiske anordninger giver os mulighed for at overvinde de begrænsninger, der er forbundet med at studere udviklingsmekanobiologi under human blodudvikling in vivo.
Det overordnede mål med protokollen i dette manuskript er trin for trin at beskrive den eksperimentelle pipeline for at studere effekten af forskydningsstress på humane endotelceller afledt in vitro fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC’er). Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner om differentiering af hiPSC’er i endotelceller og deres efterfølgende såning i fluidiske chips til stimuleringsprotokollen. Ved hjælp af dette kan forskellige in vitro-afledte endotelceller testes for deres evne til at mærke forskydningsspændingen ved at analysere deres orientering som reaktion på strømmen. Dette vil gøre det muligt for andre laboratorier at behandle spørgsmål om responsen på forskydningsstress og dens funktionelle konsekvenser for forskellige endotelcelleidentiteter.
Protokollen, som vi beskriver her, giver mulighed for generering af mekanofølsomme endotelceller fra humane pluripotente stamceller og undersøgelse af deres respons på mekanisk stimulering medieret af kontrolleret forskydningsspænding. Denne protokol er fuldstændig cytokinbaseret og fuldt kompatibel med GMP-reagenser til potentiel oversættelse til produktion af celler til celleterapi.
Afledningen af hiPSC’er giver forskere en instrumentel model for de tidlige stadier af embryonal udvikling, der gør det muligt at studere processer, der ellers er vanskelige at studere in vivo24. Faktisk indsamles humant embryonalt væv, der er tilgængeligt til forskning, fra embryoner, der mangler cirkulation, og dette kan have en betydelig indvirkning på den molekylære signatur, der styres af mekaniske signaler. Den her beskrevne tilgang muliggør live-imaging og realtidsundersøgelse af cellerespons på forskydningsstress. Kombinationen af hiPSC’er med fluidik giver en undersøgelsesmodel, der overvinder den begrænsede tilgængelighed og utilgængeligheden af det udviklende fostervæv, når initieringen af cirkulation ombygger og styrer etableringen af det kardiovaskulære system og blodsystemet 3,9,10,25.
En begrænsning af protokollen er, at endotelcellerne afledt af denne protokol muligvis ikke afspejler de forskellige identiteter af forskellige endotelceller, der er til stede i det udviklende væv. For at overvinde denne begrænsning kan en specifik kombination af cytokiner være nødvendig under differentieringsprocessen forud for den flydende stimulering for at opnå den ønskede identitet eller vævsspecifikke fænotype26. Isoleringen af endotelundergrupper kan opnås under anvendelse af en mere raffineret immunofænotype under isolationstrinnet. Denne protokol isolerer endotelceller udelukkende baseret på ekspressionen af CD34, hvilket muliggør kolonneisolering i stedet for fluorescensaktiveret cellesortering (FACS); Dette reducerer celledød og risikoen for kontaminering. Desuden er denne protokol specielt designet til at studere rollen som forskydningsspænding medieret af laminær strømning. Alternative fluidiske tilgange skal anvendes til at undersøge virkningen af andre mekaniske signaler, såsom strækning eller kompression, eller andre typer strømning såsom forstyrret eller forstyrret strømning.
Vi har tidligere vist, at iPSC-afledte endotelceller efterligner de heterogene arteriovenøse cellulære identiteter27 svarende til den, der observeres i føtal dorsal aorta28,29,30. Dette er af særlig betydning i forbindelse med karudvikling og cellulær specifikation, der vides at være kontrolleret af blodcirkulationen. Undersøgelser i forskellige modeller viste, at manglende cirkulation resulterer i ændret arteriovenøs specifikation11,14,31. De mekanismer, der forbinder mekaniske signaler med cellespecifikation, er stadig ukendte, og rørledningen beskrevet her giver mulighed for raffinerede funktionelle undersøgelser, der ikke kunne testes in vivo.
Denne pipeline beskriver produktionen og stimuleringen af endotelceller afledt af hiPSC’er ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluidiske kanaler, hvorved behovet for støbning af udstyret undgås som for de almindeligt anvendte polydimethylsiloxananordninger (PDMS)12. Desuden gør brugen af PDMS-chips indsamlingen af de stimulerede celler særligt udfordrende, mens cellerne med denne protokol let kan hentes fra kanalen. Dette forbedrer analysekraften betydeligt, hvilket muliggør efterfølgende analyse, såsom proteomiske og transkriptomiske analyser, flowcytometri og funktionelle assays, som muligvis kræver yderligere dyrkning eller in vivo-assays .
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Research Advanced Grant 2021 fra European Hematology Association, Global Research Award 2021 fra American Society of Hematology og Internal Strategy Support Fund ISSF3 finansieret af Welcome Trust og University of Edinburgh. Vi takker Fiona Rossi fra Flow Cytometry Facility for støtte i flowcytometrianalysen. Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY) licens til enhver forfatteraccepteret manuskriptversion, der opstår som følge af denne indsendelse.
0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
EDTA | Life technologies | 15575020 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
Fiji | Version 1.53c | ||
Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
MTG | Merck | M6145-25ML | |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |