Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala

Summary

Qui, presentiamo due protocolli per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in matrici di idrogel su macroscala senza la necessità di una fase liquida esterna.

Abstract

Le reti di geni sintetici forniscono una piattaforma per scienziati e ingegneri per progettare e costruire nuovi sistemi con funzionalità codificate a livello genetico. Mentre il paradigma dominante per l'implementazione di reti geniche è all'interno di un telaio cellulare, le reti genetiche sintetiche possono anche essere implementate in ambienti privi di cellule. Le applicazioni promettenti delle reti di geni privi di cellule includono i biosensori, poiché questi dispositivi sono stati dimostrati contro bersagli biotici (virus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abiotici (metalli pesanti, solfuri, pesticidi e altri contaminanti organici). I sistemi privi di cellule sono tipicamente distribuiti in forma liquida all'interno di un recipiente di reazione. Essere in grado di incorporare tali reazioni in una matrice fisica, tuttavia, può facilitare la loro più ampia applicazione in un insieme più ampio di ambienti. A tal fine, sono stati sviluppati metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica libera da cellule (CFPS) in una varietà di matrici di idrogel. Una delle proprietà chiave degli idrogel che favoriscono questo lavoro è l'elevata capacità di ricostituzione dell'acqua dei materiali idrogel. Inoltre, gli idrogel possiedono caratteristiche fisiche e chimiche funzionalmente vantaggiose. Gli idrogel possono essere liofilizzati per la conservazione e reidratati per un uso successivo. Vengono presentati due protocolli passo-passo per l'inclusione e il dosaggio delle reazioni CFPS negli idrogel. In primo luogo, un sistema CFPS può essere incorporato in un idrogel tramite reidratazione con un lisato cellulare. Il sistema all'interno dell'idrogel può quindi essere indotto o espresso costitutivamente per la completa espressione proteica attraverso l'idrogel. In secondo luogo, il lisato cellulare può essere introdotto in un idrogel nel punto di polimerizzazione e l'intero sistema può essere liofilizzato e reidratato in un secondo momento con una soluzione acquosa contenente l'induttore per il sistema di espressione codificato all'interno dell'idrogel. Questi metodi hanno il potenziale per consentire reti geniche prive di cellule che conferiscono capacità sensoriali ai materiali idrogel, con il potenziale per la distribuzione al di fuori del laboratorio.

Introduction

La biologia sintetica integra diverse discipline ingegneristiche per progettare e ingegnerizzare parti, dispositivi e sistemi a base biologica in grado di svolgere funzioni che non si trovano in natura. La maggior parte degli approcci di biologia sintetica sono ancora legati a cellule viventi. Al contrario, i sistemi di biologia sintetica senza cellule facilitano livelli senza precedenti di controllo e libertà nella progettazione, consentendo una maggiore flessibilità e un tempo ridotto per l'ingegnerizzazione dei sistemi biologici, eliminando al contempo molti dei vincoli dei tradizionali metodi di espressione genica basati sulle cellule

Protocol

1. Tampone di lisato cellulare e preparazione dei terreni

1. Preparazione di 2x YT+P agar e terreno
   1. Preparare 2x YT+P agar misurando 16 g/L di triptone, 10 g/L di estratto di lievito, 5 g/L di NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH₂PO₄ e 15 g/L di agar. Per il brodo 2x YT+P, seguire la composizione precedente ma omettere l'agar.
   2. Sterilizzare in autoclave il 2x YT+P.
2. Preparazione del tampone S30A
   1. Preparare il tampone S30A con 5,88 g/L di Mg-glutammato, 12,195 g/L di K-glutammato e 25 mL/L 2 M Tris, regolato a pH 7,7 con acido acetico.
   2. Conse....

Results

Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi per incorporare le reazioni CFPS in matrici di idrogel, con la Figura 1 che presenta una panoramica schematica dei due approcci. Entrambi i metodi sono suscettibili di liofilizzazione e conservazione a lungo termine. Il metodo A è il metodo più utilizzato per due motivi. In primo luogo, è stato dimostrato che è il metodo più applicabile per lavorare con una gamma di materiali idrogel¹¹. In secondo luogo, il metodo A c.......

Discussion

Di seguito sono delineati due protocolli per l'incorporazione di reazioni CFPS a base di lisato di cellule di E. coli in idrogel di agarosio. Questi metodi consentono l'espressione genica simultanea in tutto il materiale. Il protocollo può essere adattato ad altri sistemi CFPS ed è stato condotto con successo con i kit CFPS disponibili in commercio, oltre ai lisati cellulari preparati in laboratorio descritti qui. È importante sottolineare che il protocollo consente l'espressione genica in assenza di una fase li.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acido acetico	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarosio	Severn Biotech	30-15-50
Kit campionatore di aminoacidi	VWR
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzima A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Acido folinico	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutammato	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lisozima	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutammato	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Idrossido di potassio (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Fosfato di potassio bibasico (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Cocktail di inibitori della proteasi	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Kit di concentrazione proteica	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidina	Sigma-Aldrich	85558-1G
Triptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Estratto di lievito	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
strong>Equipment
1,5 mL provette per microcentrifuga	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
Cassette per dialisi MWCO 10K	Thermo Fisher Scientific	66381
Provetta da centrifuga da 15 mL	Sarstedt	62.554.502
Flaconi da centrifuga da 50 mL	Sarstedt	62.547.254
Flaconi da centrifuga da 500 mL	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus Liofilizzatore	Christ	codice 101521, 101522, 101527
Centrifuga da banco	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Piastre per microtitolazione a 384 pozzetti	Fischer Scientific	66
Cuvette	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuga 5425R	Eppendorf	EP00532
Centrifuga ad alta velocità	Beckman Coulter	B34183
Licenza JMP	SAS Institute	15
Agitatore magnetico	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Fotospettrometro (biofotometro)	Eppendorf	16713
Pipette e puntali	Gilson	#####
Bilancia di precisione	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorimetro	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Incubatore a scuotimento	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Incubatore statico	Sanyo	MIR-162
Siringa e aghi	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (incubatore a scuotimento)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/° c contatore	VWR	662-1657