In dieser Arbeit stellen wir zwei Protokolle zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogelmatrices vor, ohne dass eine externe Flüssigphase erforderlich ist.
Synthetische Gennetzwerke bieten Wissenschaftlern und Ingenieuren eine Plattform, um neuartige Systeme mit Funktionen zu entwerfen und zu bauen, die auf genetischer Ebene kodiert sind. Während das vorherrschende Paradigma für den Einsatz von Gennetzwerken innerhalb eines zellulären Chassis liegt, können synthetische Gennetzwerke auch in zellfreien Umgebungen eingesetzt werden. Zu den vielversprechenden Anwendungen zellfreier Gennetzwerke gehören Biosensoren, da diese Geräte gegen biotische (Ebola-, Zika- und SARS-CoV-2-Viren) und abiotische (Schwermetalle, Sulfide, Pestizide und andere organische Verunreinigungen) Ziele nachgewiesen wurden. Zellfreie Systeme werden in der Regel in flüssiger Form in einem Reaktionsgefäß eingesetzt. Die Möglichkeit, solche Reaktionen in eine physikalische Matrix einzubetten, kann jedoch ihre breitere Anwendung in einer breiteren Palette von Umgebungen erleichtern. Zu diesem Zweck wurden Methoden zur Einbettung von Reaktionen der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) in eine Vielzahl von Hydrogelmatrices entwickelt. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Hydrogelen, die für diese Arbeit förderlich sind, ist die hohe Wasserrekonstitutionskapazität von Hydrogelmaterialien. Darüber hinaus besitzen Hydrogele physikalische und chemische Eigenschaften, die funktionell vorteilhaft sind. Hydrogele können für die Lagerung gefriergetrocknet und für die spätere Verwendung rehydriert werden. Es werden zwei Schritt-für-Schritt-Protokolle für den Einschluss und die Analyse von CFPS-Reaktionen in Hydrogelen vorgestellt. Zunächst kann ein CFPS-System durch Rehydrierung mit einem Zelllysat in ein Hydrogel eingebaut werden. Das System innerhalb des Hydrogels kann dann für eine vollständige Proteinexpression durch das Hydrogel induziert oder konstitutiv exprimiert werden. Zweitens kann Zelllysat am Punkt der Polymerisation in ein Hydrogel eingebracht werden, und das gesamte System kann gefriergetrocknet und zu einem späteren Zeitpunkt mit einer wässrigen Lösung rehydriert werden, die den Induktor für das in dem Hydrogel kodierte Expressionssystem enthält. Diese Methoden haben das Potenzial, zellfreie Gennetzwerke zu ermöglichen, die Hydrogelmaterialien sensorische Fähigkeiten verleihen, mit dem Potenzial, über das Labor hinaus eingesetzt zu werden.
Die synthetische Biologie integriert verschiedene Ingenieurdisziplinen, um biologisch basierte Teile, Geräte und Systeme zu entwerfen und zu konstruieren, die Funktionen ausführen können, die in der Natur nicht vorkommen. Die meisten Ansätze der synthetischen Biologie sind immer noch an lebende Zellen gebunden. Im Gegensatz dazu ermöglichen zellfreie Systeme der synthetischen Biologie ein noch nie dagewesenes Maß an Kontrolle und Freiheit beim Design, was eine erhöhte Flexibilität und eine verkürzte Zeit für die Entwicklung biologischer Systeme ermöglicht und gleichzeitig viele der Einschränkungen herkömmlicher zellbasierter Genexpressionsmethoden beseitigt 1,2,3. CFPS wird in einer zunehmenden Anzahl von Anwendungen in zahlreichen Disziplinen eingesetzt, darunter die Konstruktion künstlicher Zellen, das Prototyping genetischer Schaltkreise, die Entwicklung von Biosensoren und die Herstellung von Metaboliten 4,5,6. CFPS ist auch besonders nützlich für die Herstellung rekombinanter Proteine, die in lebenden Zellen nicht ohne weiteres exprimiert werden können, wie z. B. aggregationsanfällige Proteine, Transmembranproteine und toxische Proteine 6,7,8.
CFPS wird in der Regel in flüssigen Reaktionen durchgeführt. Dies kann jedoch ihren Einsatz in einigen Situationen einschränken, da jede flüssigkeitszellfreie Vorrichtung in einem Reaktionsgefäß enthalten sein muss. Der Grundgedanke für die Entwicklung der hier vorgestellten Methoden bestand darin, robuste Protokolle für die Einbettung zellfreier Geräte der synthetischen Biologie in Hydrogele bereitzustellen, nicht als Proteinproduktionsplattform an sich, sondern um die Verwendung von Hydrogelen als physisches Chassis für den Einsatz zellfreier Geräte außerhalb des Labors zu ermöglichen. Die Verwendung von Hydrogelen als CFPS-Chassis hat mehrere Vorteile. Hydrogele sind polymere Materialien, die trotz eines hohen Wassergehalts (manchmal über 98%) feste Eigenschaftenbesitzen 9,10,11. Sie werden als Pasten, Gleitmittel und Klebstoffe verwendet und sind in so unterschiedlichen Produkten wie Kontaktlinsen, Wundauflagen, Marineklebebändern, Bodenverbesserungsmitteln und Babywindeln enthalten 9,11,12,13,14. Hydrogele werden auch aktiv als Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten untersucht 9,15,16,17. Hydrogele können auch biokompatibel und biologisch abbaubar sein und einige eigene Reizreaktionen besitzen 9,18,19,20. Ziel ist es daher, eine Synergie zwischen molekularbiologischer Funktionalität und Materialwissenschaft zu schaffen. Zu diesem Zweck wurden Anstrengungen unternommen, die zellfreie synthetische Biologie mit einer Reihe von Materialien zu integrieren, darunter Kollagen, Laponit, Polyacrylamid, Fibrin, PEG-Peptid und Agarose 11,21,22 sowie Oberflächen aus Glas, Papier und Stoff zu beschichten 11,23,24 mit CFPS-Geräten. Die hier vorgestellten Protokolle demonstrieren zwei Methoden zur Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Matrizen im Makromaßstab (d. h. >1 mm), wobei Agarose als Beispielmaterial verwendet wird. Agarose wurde aufgrund ihrer hohen Wasseraufnahmefähigkeit, ihrer kontrollierten Selbstgelierungseigenschaften und ihrer einstellbaren mechanischen Eigenschaften ausgewählt 11,24,25,26. Agarose unterstützt auch funktionelle CFPS, ist billiger als viele andere Hydrogel-Alternativen und biologisch abbaubar, was sie zu einer attraktiven Wahl als experimentelles Modellsystem macht. Diese Methoden haben sich jedoch bereits als geeignet für die Einbettung von CFPS in eine Reihe alternativer Hydrogele erwiesen11. Unter Berücksichtigung des breiten Anwendungsspektrums von Hydrogelen und der Funktionalität von CFPS können die hier vorgestellten Methoden eine Grundlage bieten, auf der Forscher biologisch verbesserte Hydrogelmaterialien entwickeln können, die für ihre Zwecke geeignet sind.
In früheren Studien wurden Mikrogelsysteme mit einem Größenbereich von 1 μm bis 400 μm verwendet, um CFPS in Hydrogelen durchzuführen, die in den Reaktionspuffer 23,27,28,29,30,31 getaucht sind. Die Anforderung, Hydrogele in CFPS-Reaktionspuffer einzutauchen, schränkt jedoch die Möglichkeiten für ihren Einsatz als eigenständige Materialien ein. Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogelen, ohne dass die Gele in Reaktionspuffer getaucht werden müssen. Zweitens ermöglicht die Verwendung von makroskaligen Gelen (zwischen 2 mm und 10 mm Größe) die Untersuchung der physikalischen Wechselwirkung zwischen Hydrogelen und zellfreier Genexpression. Zum Beispiel ist es mit dieser Technik möglich, zu untersuchen, wie die Hydrogelmatrix die CFPS-Reaktionen11 beeinflusst und wie CFPS-Reaktionen die Hydrogelmatrix31 beeinflussen können. Größere Abmessungen von Hydrogelen ermöglichen auch die Entwicklung neuartiger, bioprogrammierbarer Materialien32. Schließlich besteht durch die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogele auch eine potenzielle Reduzierung des Bedarfs an Kunststoff-Reaktionsgefäßen. Für den Einsatz von zellfreien Sensoren hat dies klare Vorteile gegenüber Geräten, die auf Kunststoffware angewiesen sind. Zusammenfassend bietet die Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogele mehrere Vorteile für den Einsatz zellfreier Geräte außerhalb des Labors.
Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, die Durchführung von CFPS-Reaktionen innerhalb von Hydrogel-Matrizen zu ermöglichen. Es werden zwei verschiedene Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinproduktionsreaktionen in makroskalige Hydrogelmaterialien demonstriert (Abbildung 1). Bei Methode A werden CFPS-Komponenten in lyophilisierte Agarose-Hydrogele eingebracht, um ein aktives System zu bilden. Bei Methode B wird geschmolzene Agarose mit CFPS-Reaktionskomponenten vermischt, um ein vollständiges CFPS-Hydrogelsystem zu bilden, das dann lyophilisiert und bis zur Verwendung gelagert wird. Diese Systeme können mit einem Volumen Wasser oder Puffer und Analyt rehydriert werden, um die Reaktion zu starten.
In dieser Studie werden Escherichia coli-Zelllysat-basierte Systeme verwendet. Dies sind einige der beliebtesten experimentellen CFPS-Systeme, da die Herstellung von E. coli-Zelllysaten einfach und kostengünstig ist und hohe Proteinausbeuten erzielt . Das Zelllysat wird mit den makromolekularen Komponenten ergänzt, die für die Transkription und Translation erforderlich sind, einschließlich Ribosomen, tRNAs, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen sowie Initiations-, Elongations- und Terminationsfaktoren. Insbesondere demonstriert diese Arbeit die Produktion von eGFP und mCherry in Agarose-Hydrogelen unter Verwendung von E. coli-Zelllysaten und überwacht das Auftreten von Fluoreszenz mit einem Plattenleser und konfokaler Mikroskopie . Repräsentative Ergebnisse für den Mikrotiterplattenleser sind in Whitfield et al.31 zu sehen, und die zugrunde liegenden Daten sind öffentlich zugänglich33. Darüber hinaus wird die Expression fluoreszierender Proteine in den Gelen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie bestätigt. Die beiden Protokolle, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, ermöglichen den Zusammenbau und die Lagerung von CFPS-basierten genetischen Geräten in Materia mit dem Ziel, eine geeignete physikalische Umgebung für die Verteilung zellfreier Genschaltkreise in einer Weise zu schaffen, die den Feldeinsatz unterstützt.
Im Folgenden werden zwei Protokolle für den Einbau von CFPS-Reaktionen auf Basis von E. coli-Zelllysaten in Agarose-Hydrogele beschrieben . Diese Methoden ermöglichen eine gleichzeitige Genexpression im gesamten Material. Das Protokoll kann für andere CFPS-Systeme angepasst werden und wurde zusätzlich zu den hier beschriebenen im Labor hergestellten Zelllysaten erfolgreich mit kommerziell erhältlichen CFPS-Kits durchgeführt. Wichtig ist, dass das Protokoll die Genexpression in Abwesenheit einer externen fl…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich sehr für die Unterstützung durch die Auszeichnungen des Biotechnology and Biological Sciences Research Council BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) und BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) sowie des Engineering and Physical Sciences Research Council – Defence Science and Technology Laboratories Award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Die Daten zu dieser Veröffentlichung sind unter folgender Adresse verfügbar: 10.25405/data.ncl.22232452. Zum Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet.
Material | |||
3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
GTP | Carbosynth | NG01208 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
PEG-8000 | Promega | V3011 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
Equipment | |||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
JMP license | SAS Institute | 15 | |
Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
Parafilm | Amcor | PM-966 | |
Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |