Qui, presentiamo due protocolli per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in matrici di idrogel su macroscala senza la necessità di una fase liquida esterna.
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Articolo metodologico
Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le reti di geni sintetici forniscono una piattaforma per scienziati e ingegneri per progettare e costruire nuovi sistemi con funzionalità codificate a livello genetico. Mentre il paradigma dominante per l'implementazione di reti geniche è all'interno di un telaio cellulare, le reti genetiche sintetiche possono anche essere implementate in ambienti privi di cellule. Le applicazioni promettenti delle reti di geni privi di cellule includono i biosensori, poiché questi dispositivi sono stati dimostrati contro bersagli biotici (virus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abiotici (metalli pesanti, solfuri, pesticidi e altri contaminanti organici). I sistemi privi di cellule sono tipicamente distribuiti in forma liquida all'interno di un recipiente di reazione. Essere in grado di incorporare tali reazioni in una matrice fisica, tuttavia, può facilitare la loro più ampia applicazione in un insieme più ampio di ambienti. A tal fine, sono stati sviluppati metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica libera da cellule (CFPS) in una varietà di matrici di idrogel. Una delle proprietà chiave degli idrogel che favoriscono questo lavoro è l'elevata capacità di ricostituzione dell'acqua dei materiali idrogel. Inoltre, gli idrogel possiedono caratteristiche fisiche e chimiche funzionalmente vantaggiose. Gli idrogel possono essere liofilizzati per la conservazione e reidratati per un uso successivo. Vengono presentati due protocolli passo-passo per l'inclusione e il dosaggio delle reazioni CFPS negli idrogel. In primo luogo, un sistema CFPS può essere incorporato in un idrogel tramite reidratazione con un lisato cellulare. Il sistema all'interno dell'idrogel può quindi essere indotto o espresso costitutivamente per la completa espressione proteica attraverso l'idrogel. In secondo luogo, il lisato cellulare può essere introdotto in un idrogel nel punto di polimerizzazione e l'intero sistema può essere liofilizzato e reidratato in un secondo momento con una soluzione acquosa contenente l'induttore per il sistema di espressione codificato all'interno dell'idrogel. Questi metodi hanno il potenziale per consentire reti geniche prive di cellule che conferiscono capacità sensoriali ai materiali idrogel, con il potenziale per la distribuzione al di fuori del laboratorio.
Introduzione
La biologia sintetica integra diverse discipline ingegneristiche per progettare e ingegnerizzare parti, dispositivi e sistemi a base biologica in grado di svolgere funzioni che non si trovano in natura. La maggior parte degli approcci di biologia sintetica sono ancora legati a cellule viventi. Al contrario, i sistemi di biologia sintetica senza cellule facilitano livelli senza precedenti di controllo e libertà nella progettazione, consentendo una maggiore flessibilità e un tempo ridotto per l'ingegnerizzazione dei sistemi biologici, eliminando al contempo molti dei vincoli dei tradizionali metodi di espressione genica basati sulle cellule
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Protocollo
1. Tampone di lisato cellulare e preparazione dei terreni
- Preparazione di 2x YT+P agar e terreno
- Preparare 2x YT+P agar misurando 16 g/L di triptone, 10 g/L di estratto di lievito, 5 g/L di NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH2PO4 e 15 g/L di agar. Per il brodo 2x YT+P, seguire la composizione precedente ma omettere l'agar.
- Sterilizzare in autoclave il 2x YT+P.
- Preparazione del tampone S30A
- Preparare il tampone S30A con 5,88 g/L di Mg-glutammato, 12,195 g/L di K-glutammato e 25 mL/L 2 M Tris, regolato a pH 7,7 con acido acetico.
- Conse....
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Risultati
Questo protocollo descrive in dettaglio due metodi per incorporare le reazioni CFPS in matrici di idrogel, con la Figura 1 che presenta una panoramica schematica dei due approcci. Entrambi i metodi sono suscettibili di liofilizzazione e conservazione a lungo termine. Il metodo A è il metodo più utilizzato per due motivi. In primo luogo, è stato dimostrato che è il metodo più applicabile per lavorare con una gamma di materiali idrogel11. In secondo luogo, il metodo A c.......
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Discussione
Di seguito sono delineati due protocolli per l'incorporazione di reazioni CFPS a base di lisato di cellule di E. coli in idrogel di agarosio. Questi metodi consentono l'espressione genica simultanea in tutto il materiale. Il protocollo può essere adattato ad altri sistemi CFPS ed è stato condotto con successo con i kit CFPS disponibili in commercio, oltre ai lisati cellulari preparati in laboratorio descritti qui. È importante sottolineare che il protocollo consente l'espressione genica in assenza di una fase li.......
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Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il sostegno dei premi BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), e del premio EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). I dati a supporto di questa pubblicazione sono disponibili all'indirizzo: 10.25405/data.ncl.22232452. Ai fini dell'accesso aperto, l'autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall'autore.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiale | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acido acetico | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarosio | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Kit campionatore di aminoacidi | VWR | ||
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzima A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Acido folinico | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutammato | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutammato | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Idrossido di potassio (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Fosfato di potassio bibasico (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Kit di concentrazione proteica | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidina | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Triptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Estratto di lievito | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| strong>Equipment | |||
| 1,5 mL provette per microcentrifuga | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| Cassette per dialisi MWCO 10K | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| Provetta da centrifuga da 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Flaconi da centrifuga da 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Flaconi da centrifuga da 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus Liofilizzatore | Christ | codice 101521, 101522, 101527 | |
| Centrifuga da banco | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Piastre per microtitolazione a 384 pozzetti | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuga 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| Centrifuga ad alta velocità | Beckman Coulter | B34183 | |
| Licenza JMP | SAS Institute | 15 | |
| Agitatore magnetico | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Fotospettrometro (biofotometro) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipette e puntali | Gilson | ##### | |
| Bilancia di precisione | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorimetro | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Incubatore a scuotimento | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Incubatore statico | Sanyo | MIR-162 | |
| Siringa e aghi | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (incubatore a scuotimento) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/° c contatore | VWR | 662-1657 |
Riferimenti
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbo....
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Ristampe e permessi
