Методы встраивания реакций синтеза внеклеточных белков в гидрогели макромасштаба
Summary
В данной работе мы представляем два протокола для встраивания внеклеточных реакций синтеза белка в макромасштабные гидрогелевые матрицы без необходимости использования внешней жидкой фазы.
Abstract
Синтетические генные сети предоставляют ученым и инженерам платформу для проектирования и создания новых систем с функциональностью, закодированной на генетическом уровне. В то время как доминирующей парадигмой развертывания генных сетей является клеточное шасси, синтетические генные сети также могут быть развернуты в бесклеточной среде. Многообещающие области применения внеклеточных генных сетей включают биосенсоры, поскольку эти устройства были продемонстрированы против биотических (вирусы Эбола, Зика и SARS-CoV-2) и абиотических (тяжелые металлы, сульфиды, пестициды и другие органические загрязнители) мишеней. Бесклеточные системы, как правило, развертываются в жидкой форме в реакционном сосуде. Однако возможность встраивания таких реакций в физическую матрицу может способствовать их более широкому применению в более широком наборе сред. С этой целью разработаны методы встраивания реакций бесклеточного синтеза белка (CFPS) в различные гидрогелевые матрицы. Одним из ключевых свойств гидрогелей, способствующих этой работе, является высокая водовосстанавливающая способность гидрогелевых материалов. Кроме того, гидрогели обладают физическими и химическими характеристиками, которые являются функционально полезными. Гидрогели можно сублимировать для хранения и регидратировать для последующего использования. Представлены два пошаговых протокола включения и анализа реакций CFPS в гидрогелях. Во-первых, система CFPS может быть включена в гидрогель путем регидратации клеточным лизатом. Затем система внутри гидрогеля может быть индуцирована или экспрессирована конститутивно для полной экспрессии белка через гидрогель. Во-вторых, клеточный лизат может быть введен в гидрогель в точке полимеризации, а вся система может быть сублимирована и регидратирована в более поздней точке с помощью водного раствора, содержащего индуктор для системы экспрессии, закодированной в гидрогеле. Эти методы потенциально позволяют создавать бесклеточные генные сети, которые наделяют гидрогелевые материалы сенсорными способностями, с потенциалом использования за пределами лаборатории.
Introduction
Синтетическая биология объединяет различные инженерные дисциплины для проектирования и конструирования биологически обоснованных деталей, устройств и систем, которые могут выполнять функции, не встречающиеся в природе. Большинство подходов синтетической биологии по-прежнему привязаны к живым клеткам. В отличие от них, бесклеточные системы синтетической биологии обеспечивают беспрецедентный уровень контроля и свободы в проектировании, обеспечивая большую гибкость и сокращение времени для разработки биологических систем, устраняя при этом многие ограничения, присущие традиционным методам клеточной экспрессии генов 1,2,3. CFPS используется во все большем количестве приложений во многих дисциплинах, включая создание искусственных клеток, прототипирование генетических схем, разработку биосенсоров и производство метаболитов 4,5,6. CFPS также был особенно полезен для получения рекомбинантных белков, которые не могут быть легко экспрессированы в живых клетках, таких как белки, склонные к агрегации, трансмембранные белки и токсичные белки 6,7,8.
CFPS обычно выполняется в жидких реакциях. Это, однако, может ограничить их использование в некоторых ситуациях, поскольку любое жидкое бесклеточное устройство должно содержаться в реакционном сосуде. Обоснование разработки методов, представленных здесь, заключалось в том, чтобы обеспечить надежные протоколы для встраивания бесклеточных синтетических биологических устройств в гидрогели, не в качестве платформы для производства белка как таковой, а вместо этого позволить использовать гидрогели в качестве физического шасси для развертывания бесклеточных устройств за пределами лаборатории. Использование гидрогелей в качестве шасси CFPS имеет ряд преимуществ. Гидрогели – это полимерные материалы, которые, несмотря на высокое содержание воды (иногда превышающее 98%), обладают твердыми свойствами 9,10,11. Они используются в качестве паст, смазочных материалов и клеев и присутствуют в таких разнообразных продуктах, как контактные линзы, повязки для ран, морские клейкие ленты, улучшители почвы и детские подгузники 9,11,12,13,14. Гидрогели также активно исследуются в качестве средств доставки лекарств 9,15,16,17. Гидрогели также могут быть биосовместимыми, биоразлагаемыми и обладать некоторыми собственными реакциями на стимулы 9,18,19,20. Таким образом, цель состоит в том, чтобы создать синергию между функциональностью, основанной на молекулярной биологии, и материаловедением. С этой целью были предприняты усилия по интеграции бесклеточной синтетической биологии с целым рядом материалов, включая коллаген, лапонит, полиакриламид, фибрин, ПЭГ-пептид и агарозу 11,21,22, а также для покрытия поверхностей из стекла, бумаги и ткани 11,23,24 с устройствами CFPS. Представленные здесь протоколы демонстрируют два метода встраивания реакций CFPS в макромасштабные (т.е. >1 мм) гидрогелевые матрицы с использованием агарозы в качестве образцового материала. Агароза была выбрана из-за ее высокой водопоглощающей способности, контролируемых самогелеобразующих свойств и настраиваемых механических свойств 11,24,25,26. Агароза также поддерживает функциональный CFPS, дешевле, чем многие другие альтернативы гидрогелю, и является биоразлагаемой, что делает ее привлекательным выбором в качестве экспериментальной модельной системы. Однако ранее было продемонстрировано, что эти методы подходят для встраивания CFPS в ряд альтернативных гидрогелей11. Учитывая широкий спектр применения гидрогелей и функциональность CFPS, демонстрируемые здесь методы могут обеспечить основу, на основе которой исследователи смогут разрабатывать биологически улучшенные гидрогелевые материалы, подходящие для их собственных целей.
В предыдущих исследованиях микрогелевые системы с диапазоном размеров от 1 мкм до 400 мкм использовались для выполнения CFPS в гидрогелях, погруженных в реакционный буфер 23,27,28,29,30,31. Однако необходимость погружения гидрогелей в реакционные буферы CFPS ограничивает возможности их использования в качестве самостоятельных материалов. Протоколы, представленные здесь, позволяют проводить реакции CFPS в гидрогелях без необходимости погружения гелей в реакционные буферы. Во-вторых, использование макромасштабных гелей (размером от 2 мм до 10 мм) позволяет изучать физическое взаимодействие между гидрогелями и бесклеточной экспрессией генов. Например, с помощью этого метода можно изучить, как гидрогелевая матрица влияет на реакцииCFPS 11 и как реакции CFPS могут влиять на гидрогелевую матрицу31. Большие размеры гидрогелей также позволяют разрабатывать новые биопрограммируемые материалы32. Наконец, встраивание реакций CFPS в гидрогели также потенциально снижает потребность в пластических реакционных сосудах. Что касается бесклеточных датчиков, это имеет явные преимущества по сравнению с устройствами, зависящими от пластиковой посуды. В совокупности встраивание реакций CFPS в гидрогели дает несколько преимуществ для развертывания бесклеточных устройств за пределами лаборатории.
Общая цель представленных здесь методов состоит в том, чтобы обеспечить протекание реакций CFPS в гидрогелевых матрицах. Продемонстрированы два различных метода встраивания внеклеточных реакций производства белка в гидрогелевые материалы макромасштаба (рис. 1). В методе А компоненты CFPS вводят в лиофилизированные агарозные гидрогели с образованием активной системы. В методе B расплавленная агароза смешивается с компонентами реакции CFPS с образованием полной гидрогелевой системы CFPS, которая затем лиофилизируется и хранится до тех пор, пока не понадобится. Эти системы могут быть регидратированы объемом воды или буфера и аналита, чтобы начать реакцию.
В этом исследовании используются системы на основе лизата клеток Escherichia coli. Это одни из самых популярных экспериментальных систем CFPS, так как приготовление лизата клеток E. coli простое, недорогое и обеспечивает высокий выход белка. Клеточный лизат дополняют макромолекулярными компонентами, необходимыми для выполнения транскрипции и трансляции, включая рибосомы, тРНК, аминоацил-тРНК-синтетазы, а также факторы инициации, элонгации и терминации. В частности, в данной работе демонстрируется продукция eGFP и mCherry в агарозных гидрогелях с использованием лизатов клеток E. coli и отслеживается появление флуоресценции с помощью планшетного ридера и конфокальной микроскопии. Репрезентативные результаты для микротитрового планшета можно увидеть в работе Whitfield et al.31, а исходные данные находятся в открытом доступе 33. Кроме того, экспрессия флуоресцентных белков во всех гелях подтверждается с помощью конфокальной микроскопии. Два протокола, продемонстрированные в этой статье, позволяют собирать и хранить генетические устройства на основе CFPS в материи с конечной целью создания подходящей физической среды для распределения бесклеточных генных схем способом, поддерживающим развертывание в полевых условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь описаны два протокола для включения реакций CFPS на основе лизата клеток E. coli в агарозные гидрогели. Эти методы позволяют обеспечить одновременную экспрессию генов по всему материалу. Протокол может быть адаптирован для других систем CFPS и был успешно проведен с коммерчески до…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают глубокую признательность Научно-исследовательскому совету по биотехнологии и биологическим наукам за поддержку наград BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) и BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), а также Исследовательского совета по инженерным и физическим наукам – Оборонные научно-технические лаборатории EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Данные, подтверждающие данную публикацию, находятся в открытом доступе по адресу: 10.25405/data.ncl.22232452. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Riferimenti
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
- Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
- Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
- Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
- Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
- Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochimica. 55 (30), 4212-4219 (2016).
- Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
- Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
- Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
- Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
- Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
- Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
- Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
- Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
- Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
- Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
- Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
- Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
- Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
- Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
- Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
- Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
- Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
- Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
- Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
- Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , (2020).
- Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).
