Metoder för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner i hydrogeler på makronivå
Summary
Här presenterar vi två protokoll för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner i hydrogelmatriser på makroskala utan behov av en extern vätskefas.
Abstract
Syntetiska gennätverk ger en plattform för forskare och ingenjörer att designa och bygga nya system med funktionalitet kodad på genetisk nivå. Medan det dominerande paradigmet för utbyggnaden av gennätverk ligger inom ett cellulärt chassi, kan syntetiska gennätverk också användas i cellfria miljöer. Lovande tillämpningar av cellfria gennätverk inkluderar biosensorer, eftersom dessa enheter har demonstrerats mot biotiska (Ebola, Zika och SARS-CoV-2-virus) och abiotiska (tungmetaller, sulfider, bekämpningsmedel och andra organiska föroreningar) mål. Cellfria system används vanligtvis i flytande form i ett reaktionskärler. Att kunna bädda in sådana reaktioner i en fysisk matris kan dock underlätta deras bredare tillämpning i en bredare uppsättning miljöer. För detta ändamål har metoder för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner (CFPS) i en mängd olika hydrogelmatriser utvecklats. En av de viktigaste egenskaperna hos hydrogeler som bidrar till detta arbete är hydrogelmaterialens höga vattenrekonstitutionskapacitet. Dessutom har hydrogeler fysikaliska och kemiska egenskaper som är funktionellt fördelaktiga. Hydrogeler kan frystorkas för lagring och återfuktas för användning senare. Två steg-för-steg-protokoll för inkludering och analys av CFPS-reaktioner i hydrogeler presenteras. För det första kan ett CFPS-system införlivas i en hydrogel via rehydrering med ett celllysat. Systemet i hydrogelen kan sedan induceras eller uttryckas konstitutivt för fullständigt proteinuttryck genom hydrogelen. För det andra kan celllysat introduceras till en hydrogel vid polymerisationspunkten, och hela systemet kan frystorkas och rehydreras vid ett senare tillfälle med en vattenlösning som innehåller induceraren för expressionssystemet som kodas i hydrogelen. Dessa metoder har potential att möjliggöra cellfria gennätverk som ger sensoriska förmågor till hydrogelmaterial, med potential för användning utanför laboratoriet.
Introduction
Syntetisk biologi integrerar olika tekniska discipliner för att designa och konstruera biologiskt baserade delar, enheter och system som kan utföra funktioner som inte finns i naturen. De flesta metoder för syntetisk biologi är fortfarande bundna till levande celler. Cellfria system för syntetisk biologi möjliggör däremot oöverträffade nivåer av kontroll och frihet i designen, vilket möjliggör ökad flexibilitet och en förkortad tid för att konstruera biologiska system samtidigt som många av begränsningarna för traditionella cellbaserade genuttrycksmetoder elimineras 1,2,3. CFPS används i ett ökande antal tillämpningar inom många discipliner, inklusive konstruktion av artificiella celler, prototyper av genetiska kretsar, utveckling av biosensorer och produktion av metaboliter 4,5,6. CFPS har också varit särskilt användbart för att producera rekombinanta proteiner som inte lätt kan uttryckas i levande celler, såsom aggregeringsbenägna proteiner, transmembranproteiner och toxiska proteiner 6,7,8.
CFPS utförs vanligtvis i vätskereaktioner. Detta kan dock begränsa deras användning i vissa situationer, eftersom alla vätskecellsfria enheter måste finnas i ett reaktionskärler. Motivet för utvecklingen av de metoder som presenteras här var att tillhandahålla robusta protokoll för att bädda in cellfria syntetiska biologienheter i hydrogeler, inte som en proteinproduktionsplattform i sig utan istället för att möjliggöra användning av hydrogeler som ett fysiskt chassi för utplacering av cellfria enheter utanför laboratoriet. Användningen av hydrogeler som CFPS-chassi har flera fördelar. Hydrogeler är polymera material som trots en hög vattenhalt (ibland över 98%) har fasta egenskaper 9,10,11. De har användningsområden som pastor, smörjmedel och lim och finns i så olika produkter som kontaktlinser, sårförband, marina tejper, jordförbättringsmedel och barnblöjor 9,11,12,13,14. Hydrogeler är också under aktiv utredning som drug delivery vehicles 9,15,16,17. Hydrogeler kan också vara biokompatibla, biologiskt nedbrytbara och ha vissa egna stimulisvar 9,18,19,20. Därför är målet här att skapa en synergi mellan molekylärbiologisk funktionalitet och materialvetenskap. För detta ändamål har ansträngningar gjorts för att integrera cellfri syntetisk biologi med en rad material, inklusive kollagen, laponit, polyakrylamid, fibrin, PEG-peptid och agaros 11,21,22, samt för att belägga ytor av glas, papper och tyg 11,23,24 med CFPS-enheter. Protokollen som presenteras här demonstrerar två metoder för att bädda in CFPS-reaktioner i makroskala (dvs. >1 mm) hydrogelmatriser, med agaros som exempelmaterial. Agarose valdes på grund av dess höga vattenabsorptionsförmåga, kontrollerade självgelningsegenskaper och avstämbara mekaniska egenskaper 11,24,25,26. Agarose stöder också funktionell CFPS, är billigare än många andra hydrogelalternativ och är biologiskt nedbrytbart, vilket gör det till ett attraktivt val som ett experimentellt modellsystem. Dessa metoder har dock tidigare visat sig vara lämpliga för att bädda in CFPS i en rad alternativa hydrogeler11. Med tanke på det breda användningsområdet för hydrogeler och funktionaliteten hos CFPS kan de metoder som demonstreras här ge en grund från vilken forskare kan utveckla biologiskt förbättrade hydrogelmaterial som är anpassade till deras egna ändamål.
I tidigare studier har mikrogelsystem med ett storleksintervall på 1 μm till 400 μm använts för att utföra CFPS i hydrogeler nedsänkta i reaktionsbuffert 23,27,28,29,30,31. Kravet på att nedsänka hydrogeler i CFPS-reaktionsbuffertar begränsar dock möjligheterna för deras användning som material i sin egen rätt. Protokollen som presenteras här gör det möjligt för CFPS-reaktioner att inträffa i hydrogeler utan att gelerna behöver sänkas ner i reaktionsbuffertar. För det andra möjliggör användningen av geler i makroskala (mellan 2 mm och 10 mm i storlek) studier av den fysiska interaktionen mellan hydrogeler och cellfritt genuttryck. Till exempel är det med denna teknik möjligt att studera hur hydrogelmatrisen påverkar CFPS-reaktioner11 och hur CFPS-reaktioner kan påverka hydrogelmatrisen31. Större storlekar av hydrogeler möjliggör också utveckling av nya, bioprogrammerbara material32. Slutligen, genom att bädda in CFPS-reaktioner i hydrogeler, finns det också en potentiell minskning av behovet av plastreaktionskärler. För användningen av cellfria sensorer har detta tydliga fördelar jämfört med enheter som är beroende av plastvaror. Sammantaget ger inbäddning av CFPS-reaktioner i hydrogeler flera fördelar för användning av cellfria enheter utanför laboratoriet.
Det övergripande målet med de metoder som presenteras här är att möjliggöra drift av CFPS-reaktioner i hydrogelmatriser. Två olika metoder demonstreras för att bädda in cellfria proteinproduktionsreaktioner i hydrogelmaterial på makroskala (Figur 1). I metod A introduceras CFPS-komponenter till frystorkade agaroshydrogeler för att bilda ett aktivt system. I metod B blandas smält agaros med CFPS-reaktionskomponenter för att bilda ett komplett CFPS-hydrogelsystem, som sedan frystorkas och lagras tills det behövs. Dessa system kan rehydreras med en volym vatten eller buffert och analyt för att påbörja reaktionen.
Denna studie använder Escherichia coli-celllysatbaserade system. Dessa är några av de mest populära experimentella CFPS-systemen, eftersom E. coli-celllysatberedning är enkel, billig och uppnår höga proteinutbyten. Celllysatet kompletteras med de makromolekylära komponenter som behövs för att utföra transkription och translation, inklusive ribosomer, tRNA, aminoacyl-tRNA-syntetaser och initierings-, förlängnings- och termineringsfaktorer. Specifikt demonstrerar denna artikel produktionen av eGFP och mCherry i agaroshydrogeler med hjälp av E. coli-celllysat och övervakar utseendet på fluorescens med hjälp av en plattläsare och konfokalmikroskopi. Representativa resultat för mikrotiterplattläsaren kan ses i Whitfield et al.31, och underliggande data är offentligt tillgängliga 33. Vidare bekräftas uttrycket av fluorescerande proteiner i gelerna med hjälp av konfokalmikroskopi. De två protokollen som demonstreras i denna artikel möjliggör montering och lagring av CFPS-baserade genetiska enheter i materia med det slutliga målet att skapa en lämplig fysisk miljö för distribution av cellfria genkretsar på ett sätt som stöder fältutplacering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs två protokoll för inkorporering av E. coli-celllysatbaserade CFPS-reaktioner i agaroshydrogeler . Dessa metoder möjliggör samtidig genuttryck i hela materialet. Protokollet kan anpassas för andra CFPS-system och har framgångsrikt genomförts med kommersiellt tillgängliga CFPS-kit utöver de laboratorieframställda celllysaten som beskrivs här. Viktigt är att protokollet tillåter genuttryck i frånvaro av en extern vätskefas. Detta innebär att systemet är fristående och inte kräver et…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är mycket tacksamma för stödet från Biotechnology and Biological Sciences Research Council Awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) och BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), och Engineering and Physical Sciences Research Council – Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Data som stöder denna publikation är öppet tillgängliga på: 10.25405/data.ncl.22232452. För open access-ändamål har författaren tillämpat en Creative Commons Attribution (CC BY)-licens på alla Author Accepted Manuscript-versioner som uppstår.
Materials
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
Riferimenti
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
- Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
- Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
- Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
- Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
- Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochimica. 55 (30), 4212-4219 (2016).
- Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
- Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
- Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
- Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
- Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
- Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
- Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
- Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
- Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
- Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
- Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
- Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
- Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
- Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
- Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
- Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
- Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
- Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
- Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
- Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
- Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
- Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
- Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , (2020).
- Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).
