מחלות עיניים ניווניות המשפיעות על שכבת אפיתל פיגמנט הרשתית של העין יש מקורות מונוגניים ופוליגניים. מספר מודלים של מחלות ויישום תוכנה, LipidUNet, פותחו כדי לחקור מנגנונים של מחלות, כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבתי של תאים משושים הממוקמים בחלק האחורי של העין. הוא מספק הזנה ותמיכה לקולטני אור ונימים כורואידיים, מבצע פגוציטוזה של מקטעים חיצוניים של קולטני אור (POS), ומפריש ציטוקינים באופן מקוטב לשמירה על הומאוסטזיס של הרשתית החיצונית. RPE לא מתפקד, הנגרם על ידי מוטציות, הזדקנות וגורמים סביבתיים, גורם לניוון של שכבות רשתית אחרות וגורם לאובדן ראייה. מאפיין פנוטיפי מובהק של RPE מנוון הוא מרבצי שומנים עשירים בשומנים תוך ות-תאיים. משקעים אלה הם פנוטיפ נפוץ במחלות ניווניות שונות ברשתית. כדי לשחזר את פנוטיפ משקעי השומנים של ניוון רשתית מונוגני במבחנה, נוצר RPE המושרה פלוריפוטנטית שמקורה בתאי גזע (iRPE) מפיברובלסטים של חולים. קווי תאים שנוצרו מחולים עם Stargardt ומחלת ניוון רשתית מאוחרת (L-ORD) הוזנו עם קופה במשך 7 ימים כדי לשכפל את הפונקציה הפיזיולוגית RPE, מה שגרם לפתולוגיה הנגרמת על ידי קופה phagocytosis במחלות אלה. כדי ליצור מודל לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלה פוליגנית הקשורה להפעלה משלימה חלופית, iRPE אותגר עם אנפילטוקסינים משלימים חלופיים. משקעי השומנים התוך-תאיים והתת-תאיים אופיינו באמצעות אדום הנילוס, בורון-דיפירומתין (BODIPY) ואפוליפופרוטאין E (APOE). כדי לכמת את צפיפות משקעי השומנים, פותחה תוכנה מבוססת למידת מכונה, LipidUNet. התוכנה אומנה על תמונות הקרנה בעוצמה מרבית של iRPE על משטחי תרבית. בעתיד, הוא יאומן לנתח תמונות תלת מימדיות (3D) ולכמת את נפח טיפות השומנים. תוכנת LipidUNet תהיה משאב רב ערך לגילוי תרופות המפחיתות את הצטברות השומנים במודלים של מחלות.
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) הוא חד-שכבה של תאים הממוקמת בחלק האחורי של העין בסמוך לקולטני אור ברשתית. RPE ממלא תפקיד חיוני בשמירה על ראייה תקינה על ידי מתן תמיכה מטבולית ומבנית לקולטני האור. תאי RPE בריאים מאופיינים במורפולוגיה משושה מובהקת. הם מחוברים על ידי צמתים הדוקים, המאפשרים RPE לפעול כמחסום בין choriocapillaris הממוקם בצד הבסיס שלה photoreceptors הממוקם apically. כדי לשמור על המערכת האקולוגית של הרשתית, RPE מעביר מטבוליטים מרכזיים, למשל גלוקוז, לקולטני אור באופן שממזער את צריכת הגלוקוז ב-RPE1. בשל מגבלה זו, RPE תלוי במטבוליטים אחרים כדי לשמור על הצרכים המטבוליים שלהם, כולל חומצות שומן, אשר RPE ממיר לקטונים באמצעות חמצון β2. בהתחשב בנטייה של RPE להשתמש בחומצות שומן, אשר ככל הנראה ממוחזרות מעיכול מקטע חיצוני של קולטני אור (POS), כמקור אנרגיה, שינויים מזיקים במסלולי עיבוד השומנים ב- RPE מובילים לעתים קרובות, או מעורבים, הן במחלות רשתית ניווניות מונוגניות והן פוליגניות3.
ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלת עיניים ניוונית פוליגנית הגורמת לניוון RPE, נקשרה גם לאוטופגיה חריגה ולמטבוליזם שומנים בחד-שכבה RPE. הכישלון של חד-שכבה RPE לא מתפקדת לעבד קופה ולבצע פונקציות קריטיות אחרות מוביל למשקעים חוץ-תאיים (תת-RPE) הנקראים משקעים ליניאריים בסיסיים (BLinD) הממוקמים בין RPE לממברנה של ברוך – סימן היכר של פתולוגיות AMD. המרכיבים העיקריים של BLinD כוללים ליפופרוטאינים, שהנפוץ שבהם הוא אפוליפופרוטאין E (APOE)4. הצטברות של שכבות דקות של BLinD יכולה להוביל לדרוסן רך, המוכר כסימפטום קליני של AMD 5,6.
מספר קבוצות הראו כי מודלים של תאי גזע שמקורם במבחנה הגורמים לתפקוד לקוי של RPE כוללים הצטברות שומנים תת-RPE 7,8,9. Hallam et al. (2017) יצרו RPE מושרה פלוריפוטנטית נגזר תאי גזע (iRPE) מחולים עם סיכון גבוה ל- AMD עקב פולימורפיזם של הגן CFH. ה- iRPE הראה הצטברות דרוסן, כפי שמסומן על ידי APOE, וה- RPE בסיכון גבוה צבר משקעים גדולים יותר מאשר iRPE שנוצר מחולים בסיכון נמוך10.
כדי ליצור מודל במבחנה המשחזר סימני היכר תאיים של AMD, כגון טיפות שומנים ושקיעת דרוסן, קווי iRPE שנוצרו מדגימות דם של מטופלים נקבעו באמצעות פרוטוקול מונחה התפתחותית11 שפורסם בעבר. ה- iRPE היו נתונים לסרום אנושי משלים (CC-HS), תמיסה המכילה אנפילטוקסינים המחקים גורם אפשרי אחד ל- AMD: איתות משלים חלופי מוגבר8. השקיעה התאית והתת-תאית של משקעי שומנים נמדדה באמצעות סמני שומנים וליפופרוטאינים נפוצים, APOE, אדום הנילוס ו-BODIPY. באמצעות סמנים אלה, הוכח כי איתות משלים פעיל באמצעות CC-HS החמיר הצטברות שומנים בתאי iRPE8.
כדי לפתח מודל מחלה למחלה ניוונית של רשתית מונוגנית, פותחו קווי iRPE מחולים עם מחלת סטארגארדט, מחלה הנגרמת על ידי מוטציות בגן ABCA4 ב- RPE. בעבר הוכח כי כאשר ABCA4 הוא דפק החוצה, A2E lipofuscin, משקעים תוך תאיים הידוע להכיל רמות גבוהות של פוספוליפידים ותוצרי חמצון שומנים תלויי אור, מצטבר בתוך RPE12. קווי נוקאאוט ABCA4 פותחו לצד קווי המטופלים, ושניהם היו נתונים להזנת קופה. ה- Stargardt iRPE הדגים פתולוגיה הנגרמת על ידי קופה phagocytosis, והציג הצטברות שומנים מוגברת שכומתה על ידי צביעת BODIPY. RPE שמקורו ב- ABCA4 KO iPSCs היו נתונים לטיפול CC-HS; כימות אות BODIPY הראה פגם בטיפול בשומנים גם במודל מחלת סטארגרדט9.
לאור שכיחותן של מחלות אלו והצורך בטיפולים יעילים, לצד מודלי המחלה הרלוונטיים שתוארו לעיל, יש צורך לבסס שיטות איתנות לכימות יעילותם של טיפולים פוטנציאליים. כדי לכמת משקעי שומנים באופן אובייקטיבי, אוטומטי וסטנדרטי, נוצרה תוכנה מבוססת למידת מכונה, LipidUNet, כך שבשילוב עם כלי ניתוח מסכות, ניתן לזהות במהירות וביעילות שקיעת שומנים באמצעות הסמנים הנפוצים Nile Red, BODIPY ו-APOE. לאחר מכן ניתן לנתח ולהציג באופן גרפי את הנתונים הסטטיסטיים המסכמים המתקבלים באמצעות צינור ניתוח זה, מה שמאפשר השוואה קלה של תנאי הטיפול. הסכימה של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
איור 1: סכמה של הפרוטוקול: תאי RPE גדלים על צלחת של 96 בארות ומאותגרים עם סרום אנושי פעיל או מקטעים חיצוניים מטוהרים של בקר כדי למדל סוגים שונים של ניוון רשתית במבחנה. תאי RPE קבועים ומוכתמים עבור משקעי ליפופרוטאין עם אדום הנילוס, BODIPY ו- APOE. מיקרוסקופ קונפוקלי משמש לרכישת ערימות Z של חלקיקי שומנים בעלי תווית פלואורסצנטית, אשר מעובדים לאחר מכן להקרנות דו-ממדיות בעוצמה מרבית. אלגוריתם למידת מכונה אומן לזהות ולפלח נכון חלקיקי ליפופרוטאין. טבלאות סיכום המכילות ספירת חלקיקים ומדדי צורה שונים נוצרות וניתן להשתמש בהן לצורך התוויית נתונים וניתוח סטטיסטי עוקבים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
פרוטוקול זה מספק שיטה לתיוג, תמונה וכימות יעילים של משקעי שומנים במודלים מונוגניים ופוליגניים של מחלות מבחנה עבור מחלות עיניים ניווניות. התוכנה מבוססת הבינה המלאכותית, LipidUNet, ניתנת ליישום על שלושה סמני שומנים נפוצים, APOE, Nile Red ו-BODIPY, ומספקת שיטה מהירה ואוטומטית לניתוח המאפשרת לכמת להיות סטנדרטית ולא מוטה.
המגבלה העיקרית של LipidUNet היא העובדה שמערך נתוני האימון עבור הבינה המלאכותית הוגבל לתמונות הגדלה פי 40 של תאים בתרבית בלוח של 96 בארות. כתוצאה מסט תמונות האימון, LipidUNet, בצורתו הנוכחית, מוגבל לניתוח תמונות הגדלה פי 40. התוכנה יכולה לשמש לניתוח תמונות 40x של תאים בתרבית על משטחי תרבית אחרים מלבד צלחת 96 באר, אך יש להקפיד לבחון את מסכות הפלט שנוצרו כדי לאמת סף מדויק על ידי התוכנה. יהיה צורך בערכות תמונות נוספות (בהגדלות שונות) כדי להרחיב את טווח הדגימות/תמונות שהוא יכול לנתח.
לפרוטוקול מספר שלבים קריטיים. בשלב סמן השומנים, על המשתמש לאשר כי תרכובת הסימון שנבחרה (BODIPY, APOE, Nile Red) תייגה את הדגימה שלו ביעילות. תאי RPE בוגרים הם לעתים קרובות פיגמנטים כבדים, אשר יכולים לפגוע באות הפלואורסצנטי של נוגדנים immunostaining. כאשר האות הפלואורסצנטי חלש או כאשר יש יותר מדי כתמי רקע, LipidUNet אינו יכול להבחין בטיפות שומנים במדויק. מסיבה דומה, יש להשתמש בהגדרות רכישה שנבחרו כראוי לשלב ההדמיה האוטומטית של הפרוטוקול. אם התמונות המתקבלות הן באיכות ירודה, LipidUNet יתקשה להסוות כראוי תמונות ולכן הכימות יהיה לא מדויק (איור 6A-L). לבסוף, לאחר עיבוד של התמונות הוא צעד חשוב, כמו LipidUNet יש דרישות ספציפיות עבור התוכנה לעבוד.
בהשוואה לתהליכי עבודה לניתוח שומנים המשתמשים בסף ידני, או טכניקות הכוללות סף אוטומטי בתוכנה כמו פיג’י, LipidUNet מציעה פילוח לא מוטה ואמין על פני תמונות עם שקיעת שומנים משתנה, כפי שמשתקף בשיעור שגיאות קטן בזיהוי חלקיקי שומנים (איור 7). התוכנה מאפשרת כניסת משתמש לתמונות הדרכה נוספות, ומאפשרת ניתוח של מערכי תמונות מעבר לאלו המשתמשות ביעד הגדלה של פי 40 או אפילו כאלה המשתמשות בטוש שומנים אחר, כמפורט בפרוטוקול. בעתיד, התוכנה תהיה מאומנת לנתח תמונות 3D כך כימות של נפח הפקדת שומנים אפשרי. מחלות עיניים ניווניות הכרוכות בשקיעת שומנים כתורמת עיקרית לפתולוגיה נפוצות, והמקרים צפויים לעלות ככל שאוכלוסיית הקשישים מתרחבת13. מודלים מדויקים של מחלות וכלי ניתוח יעילים, כפי שתיארנו בפרוטוקול זה, יאפשרו פיתוח התערבויות טיפוליות חדשניות.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לליבת ההיסטולוגיה של המכון הלאומי לעיניים (NEI) על השימוש במערכת הקונפוקלית Zeiss. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות NEI IRP (מספר מענק ZIA EY000533-04).
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |