不动杆菌生物膜的定量、活力评估和可视化策略
Summary
该方案描述了接种物的制备，使用结晶紫染料在微量滴定板上的生物膜定量，生物膜中的活菌计数以及 不动杆菌生物膜的可视化。
Abstract
不动杆菌 会引起院内感染，其生物膜的形成有助于在医院环境等干燥表面上存活。因此，生物膜定量和可视化是评估 不动杆菌菌 株引起医院感染潜力的重要方法。在微孔板表面形成的生物膜可以根据体积和细胞数量进行量化。生物膜体积可以通过使用结晶紫染色、洗涤、使用乙醇脱色，然后使用酶标仪测量溶解染料来定量。为了量化嵌入生物膜中的细胞数量，使用细胞刮刀将生物膜刮掉，在盐水中收获，在玻璃珠存在下剧烈搅拌，并涂抹在不动杆菌琼脂上。然后，将板在30°C孵育24-42小时。孵育后，计数红色菌落以估计生物膜中的细胞数。这种可行的计数方法也可用于计数混合物种生物膜中的 不动杆菌 细胞。 不动杆菌 生物膜可以使用荧光染料进行可视化。使用设计用于显微分析的市售微孔板来形成生物膜。然后，用SYTO9和碘化丙啶染料染色底表面附着的生物膜，洗涤，然后用共聚焦激光扫描显微镜观察。
Introduction
已知不动杆菌会引起医院感染，其人类感染，尤其是在医疗机构中，越来越多的报道1.它广泛存在于医院、医疗机构和食品相关环境中 2,3,4。它可以在包括医院表面（如床栏、床头柜、呼吸机表面和水槽）在内的环境中长期存活4.这种在环境表面的持久性可能是导致不动杆菌4 院内感染的重要因素之一。
生物膜是微生物生命的一种形式，是由活的微生物细胞和来自细胞的细胞外聚合物物质（EPS）组成的微生物基质5。微生物细胞嵌入基质中，通常对环境压力（如热、盐、干燥、抗生素、消毒剂和剪切力）具有很强的抵抗力6,7。
不动杆菌可以在表面上形成生物膜，这表明它可能有助于延长在环境表面（包括医院表面）的存活时间，并增强对抗生素治疗的耐药性8,9。此外，不动杆菌的生物膜形成可能与人类临床结果高度相关8。因此，不动杆菌菌株的生物膜形成性可能是预测环境生存和人类感染的指标之一8,10。
表面附着的生物膜可以被量化和可视化，以评估生物膜的形成性。为了量化表面附着的生物膜，通常用生物膜染色染料（如结晶紫）对生物膜进行染色，并将染料在溶液中洗脱并测量光密度11。生物膜的可视化是评估生物膜形成性的另一种好方法11。与其他技术（如 SEM12,13）相比，使用荧光染料的特异性共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 可视化方法可能更有助于表征生物膜形态。
可以对生物膜中的活细胞进行计数，以估计生物膜中的活细胞数量11。将嵌入生物膜中的活细胞分离、稀释、铺在琼脂平板上、孵育和计数。由于较高的细胞数可能满足感染剂量，因此可以提供有关生物膜的更详细的信息，例如与细胞数相关的感染电位13,14。
本文介绍了 （1） 量化表面附着的生物膜，（2） 对生物膜中的活细胞进行计数，以及 （3） 使用 Acinetobacter 的 CLSM 可视化生物膜的分步方案。所提出的方案描述了评估 不动杆菌 分离株的生物膜形成性和表征其生物膜的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用所描述的方案，测量、可视化不同程度的不动杆菌分离株的生物膜形成，并估计生物膜中的活细胞（图1、图2和图3）。
在该方案中，使用两种不同的温度，30°C用于生长，25°C用于不动杆菌的生物膜形成。使用30°C是因为许多研究使用超过30°C的不动杆菌的最佳生长，这对于获得足够的…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了韩国食品研究所（KFRI）的主要研究计划（E0210702-03）的支持，该计划由科学和信息通信技术部资助。
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
Riferimenti
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
