Kvantificering, levedygtighedsvurdering og visualiseringsstrategier for Acinetobacter biofilm
Summary
Denne protokol beskriver fremstillingen af podningen, biofilmkvantificeringen på mikrotiterplader ved hjælp af krystalviolet farvestof, det levedygtige antal i biofilm og visualiseringen af biofilm af Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter forårsager nosokomielle infektioner, og dets biofilmdannelse kan bidrage til overlevelse på tørre overflader såsom hospitalsmiljøer. Biofilmkvantificering og visualisering er således vigtige metoder til at vurdere potentialet for Acinetobacter-stammer til at forårsage nosokomielle infektioner. De biofilm, der dannes på overfladen af mikropladen, kan kvantificeres med hensyn til volumen og celleantal. Biofilmvolumener kan kvantificeres ved farvning ved hjælp af krystalviolet, vask, farvning ved hjælp af ethanol og derefter måling af det opløselige farvestof ved hjælp af en mikropladelæser. For at kvantificere antallet af celler, der er indlejret i biofilmene, skrottes biofilmene ved hjælp af celleskrabere, høstes i saltvand, omrøres kraftigt i nærværelse af glasperler og spredes på Acinetobacter agar. Derefter inkuberes pladerne ved 30 °C i 24-42 timer. Efter inkubation opregnes de røde kolonier for at estimere antallet af celler i biofilm. Denne levedygtige tællemetode kan også være nyttig til tælling af Acinetobacter-celler i biofilm med blandede arter. Acinetobacter biofilm kan visualiseres ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. En kommercielt tilgængelig mikroplade designet til mikroskopisk analyse anvendes til dannelse af biofilm. Derefter farves de bundoverflademonterede biofilm med SYTO9- og propidiumiodidfarvestoffer, vaskes og visualiseres derefter med konfokal laserscanningsmikroskopi.
Introduction
Acinetobacter er kendt for at forårsage nosokomielle infektioner, og dets humane infektion, især i sundhedsfaciliteter, rapporteres i stigende grad1. Det er udbredt på hospitaler, sundhedsfaciliteter og fødevarerelaterede miljøer 2,3,4. Det kan overleve i lang tid i miljøer, herunder hospitalsoverflader såsom sengeskinner, natborde, overfladen af ventilatorer og dræn4. En sådan persistens på miljøoverflader kan være en af de væsentlige faktorer, der bidrager til de nosokomielle infektioner af Acinetobacter4.
Biofilm er en form for mikrobielt liv og er en mikrobiel matrix sammensat af levende mikrobielle celler og ekstracellulære polymere stoffer (EPS) fra cellerne5. De mikrobielle celler er indlejret i matrixen og er ofte meget modstandsdygtige over for miljøbelastninger som varme, salte, tørhed, antibiotika, desinfektionsmidler og forskydningskræfter 6,7.
Acinetobacter kan danne biofilm på overflader, hvilket tyder på, at det kan bidrage til forlænget overlevelse på miljøoverflader, herunder hospitalsoverflader, og øget resistens over for antibiotikabehandling 8,9. Derudover kan biofilmdannelsen af Acinetobacter være stærkt forbundet med humane kliniske resultater8. Derfor kan biofilmformbarheden af Acinetobacter-stammer være en af indikatorerne til forudsigelse af miljømæssig overlevelse og humane infektioner 8,10.
De overfladebundne biofilm kan kvantificeres og visualiseres for at vurdere biofilms formbarhed. For at kvantificere overfladebundne biofilm farves biofilmene normalt af biofilmfarvningsfarvestoffer såsom krystalviolet, og farvestofferne elueres i opløsning og måles for optisk densitet11. Visualisering af biofilm er en anden god tilgang til vurdering af biofilms formbarhed11. Konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) visualiseringsmetode, der anvender specificitet ved hjælp af fluorescerende farvestoffer, kan være mere nyttig til at karakterisere biofilmmorfologi sammenlignet med andre teknikker såsom SEM12,13.
De levedygtige celler i biofilm kan tælles med for at estimere antallet af levedygtige celler i biofilm11. De levedygtige celler indlejret i biofilm løsnes, fortyndes, spredes på agarplader, inkuberes og opregnes. Fordi det højere antal celler sandsynligvis opfylder den infektiøse dosis, kan det give mere detaljerede oplysninger om biofilm, såsom infektionspotentialer forbundet med antallet af celler13,14.
Denne artikel præsenterer trinvise protokoller til (1) kvantificering af overfladebundne biofilm, (2) tælling af levedygtige celler i biofilmene og (3) visualisering af biofilmene ved hjælp af CLSM af Acinetobacter. De præsenterede protokoller beskriver metoderne til vurdering af Acinetobacter-isolaters biofilmformbarhed og karakteriserer deres biofilm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjælp af den beskrevne protokol blev biofilmdannelsen af Acinetobacter-isolater i varierende grad målt, visualiseret, og de levedygtige celler i biofilmene blev estimeret (figur 1, figur 2 og figur 3).
I denne protokol blev der anvendt to forskellige temperaturer, 30 °C til vækst og 25 °C til biofilmdannelse af Acinetobacter. 30 °C blev anvendt, fordi der i mange undersøgelser…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af hovedforskningsprogrammet (E0210702-03) fra Korea Food Research Institute (KFRI), finansieret af ministeriet for videnskab og IKT.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
Riferimenti
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
