אסטרטגיות כימות, הערכת כדאיות והדמיה עבור ביופילמים של Acinetobacter
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הכנת החיסון, כימות הביופילם על לוחות מיקרוטיטר באמצעות צבע סגול גבישי, הספירה בת קיימא בביופילמים והדמיה של ביופילמים של אסינטובקטר.
Abstract
Acinetobacter גורם זיהומים nosocomial היווצרות biofilm שלה יכול לתרום להישרדות על משטחים יבשים כגון סביבות בית חולים. לפיכך, כימות ביופילם והדמיה הן שיטות חשובות להערכת הפוטנציאל של זני Acinetobacter לגרום לזיהומים nosocomial. ניתן לכמת את הביופילמים הנוצרים על פני השטח של המיקרו-צלחת במונחים של נפח ומספרי תאים. נפחי ביופילם ניתנים לכימות על ידי צביעה באמצעות סגול קריסטל, שטיפה, עיכוב באמצעות אתנול, ולאחר מכן מדידת הצבע המסיס באמצעות קורא microplate. כדי לכמת את מספר התאים המשובצים בביופילמים, מגרדים את הביופילמים באמצעות מגרדי תאים, קוצרים במי מלח, נסערים במרץ בנוכחות חרוזי זכוכית, ומפוזרים על אגר Acinetobacter. לאחר מכן, הצלחות מודגרות ב 30 ° C במשך 24-42 שעות. לאחר הדגירה, המושבות האדומות נמנות כדי להעריך את מספר התאים בביופילמים. שיטת ספירה בת קיימא זו יכולה להיות שימושית גם לספירת תאי Acinetobacter בביופילמים של מינים מעורבים. ניתן להמחיש ביופילמים של Acinetobacter באמצעות צבעים פלואורסצנטיים. מיקרו-צלחת זמינה מסחרית המיועדת לניתוח מיקרוסקופי משמשת ליצירת ביופילמים. לאחר מכן, הביופילמים המחוברים לפני השטח התחתונים מוכתמים בצבעי יודיד SYTO9 ופרופידיום, נשטפים, ואז מוצגים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
Introduction
Acinetobacter ידוע לגרום זיהומים nosocomial, זיהום אנושי שלה, במיוחד במתקני בריאות, מדווח יותר ויותר1. היא נפוצה בבתי חולים, מתקני בריאות וסביבות הקשורות למזון 2,3,4. הוא יכול לשרוד תקופה ארוכה בסביבות הכוללות משטחי בית חולים כגון מעקות מיטה, שולחנות ליד המיטה, משטח של מכונות הנשמה וכיורים4. התמדה כזו על משטחים סביבתיים עשויה להיות אחד הגורמים המשמעותיים התורמים לזיהומים נוסוקומיאליים של Acinetobacter4.
ביופילם הוא צורה של חיים מיקרוביאליים והוא מטריצה מיקרוביאלית המורכבת מתאים מיקרוביאליים חיים וחומרים פולימריים חוץ-תאיים (EPS) מהתאים5. התאים המיקרוביאליים מוטמעים במטריצה ולעתים קרובות עמידים מאוד לעקות סביבתיות כגון חום, מלחים, יובש, אנטיביוטיקה, חומרי חיטוי וכוחות גזירה 6,7.
Acinetobacter יכול ליצור ביופילמים על משטחים, דבר המצביע על כך שהוא עשוי לתרום להישרדות ממושכת על משטחים סביבתיים, כולל משטחי בתי חולים, ועמידות משופרת לטיפול אנטיביוטי 8,9. בנוסף, היווצרות ביופילם של Acinetobacter יכול להיות קשור מאוד עם תוצאות קליניות אנושיות8. לכן, היווצרות הביופילם של זני Acinetobacter יכולה להיות אחד המדדים בניבוי הישרדות סביבתית וזיהומים אנושיים 8,10.
ניתן לכמת ולהמחיש את הביופילמים המחוברים לפני השטח כדי להעריך את היווצרות הביופילם. כדי לכמת ביופילמים המחוברים לפני השטח, הביופילמים מוכתמים בדרך כלל על ידי צבעים מכתימי ביופילם כגון סגול גבישי, והצבעים מדוללים בתמיסה ונמדדים עבור צפיפות אופטית11. הדמיה של ביופילמים היא גישה טובה נוספת להערכת היווצרות ביופילם11. שיטת הדמיה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM) המשתמשת בספציפיות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים יכולה להיות שימושית יותר לאפיון מורפולוגיית ביופילם בהשוואה לטכניקות אחרות כגון SEM12,13.
ניתן לספור את התאים הקיימים בביופילמים כדי להעריך את מספר התאים הקיימים בביופילמים11. התאים בני הקיימא המשובצים בביופילמים מנותקים, מדוללים, מפוזרים על לוחות אגר, מודגרים וממוספרים. מכיוון שמספר התאים הגבוה יותר צפוי לעמוד במינון הזיהומי, הוא יכול לספק מידע מפורט יותר על ביופילמים, כגון פוטנציאלי זיהום הקשורים למספר התאים13,14.
מאמר זה מציג פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי (1) לכמת ביופילמים המחוברים לפני השטח, (2) לספור תאים ברי קיימא בביופילמים, ו-(3) לדמיין את הביופילמים באמצעות CLSM של Acinetobacter. הפרוטוקולים המוצגים מתארים את השיטות להעריך את כושר הביופילם של מבודדי Acinetobacter ולאפיין את הביופילמים שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות הפרוטוקול המתואר, היווצרות הביופילם של מבודדי Acinetobacter בדרגות שונות נמדדה, הודגמה, והוערכו התאים הקיימים בביופילמים (איור 1, איור 2 ואיור 3).
בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשתי טמפרטורות שונות, 30 מעלות צלזיוס לגידול ו-25 מע…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר העיקרית (E0210702-03) של המכון לחקר המזון של קוריאה (KFRI), במימון משרד המדע והתקשוב.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
Riferimenti
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
