एसिनेटोबैक्टर बायोफिल्म के लिए परिमाणीकरण, व्यवहार्यता मूल्यांकन और विज़ुअलाइज़ेशन रणनीतियाँ
Summary
यह प्रोटोकॉल इनोकुलम की तैयारी, क्रिस्टल वायलेट डाई का उपयोग करके माइक्रोटिटर प्लेटों पर बायोफिल्म परिमाणीकरण, बायोफिल्म में व्यवहार्य गणना और एसिनेटोबैक्टर के बायोफिल्म के विज़ुअलाइज़ेशन का वर्णन करता है।
Abstract
एसिनेटोबैक्टर नोसोकोमियल संक्रमण का कारण बनता है और इसका बायोफिल्म गठन अस्पताल के वातावरण जैसी शुष्क सतहों पर जीवित रहने में योगदान कर सकता है। इस प्रकार, बायोफिल्म परिमाणीकरण और विज़ुअलाइज़ेशन नोसोकोमियल संक्रमण पैदा करने के लिए एसिनेटोबैक्टर उपभेदों की क्षमता का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण तरीके हैं। माइक्रोप्लेट की सतह पर बनने वाले बायोफिल्म को मात्रा और सेल संख्या के संदर्भ में निर्धारित किया जा सकता है। बायोफिल्म वॉल्यूम को क्रिस्टल वायलेट का उपयोग करके धुंधला करके, धोने, इथेनॉल का उपयोग करके डिस्टेन करने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, फिर माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके घुलनशील डाई को मापा जा सकता है। बायोफिल्म में एम्बेडेड कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, बायोफिल्म को सेल स्क्रैपर्स का उपयोग करके खत्म कर दिया जाता है, खारा में काटा जाता है, कांच के मोतियों की उपस्थिति में सख्ती से उत्तेजित किया जाता है, और एसिनेटोबैक्टर एगर पर फैलाया जाता है। फिर, प्लेटों को 24-42 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है। इनक्यूबेशन बाद, बायोफिल्म में कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए लाल कॉलोनियों की गणना की जाती है। यह व्यवहार्य गणना विधि मिश्रित प्रजातियों के बायोफिल्म में एसिनेटोबैक्टर कोशिकाओं की गिनती के लिए भी उपयोगी हो सकती है। फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके एसिनेटोबैक्टर बायोफिल्म की कल्पना की जा सकती है। सूक्ष्म विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोप्लेट बायोफिल्म बनाने के लिए नियोजित किया जाता है। फिर, नीचे की सतह से जुड़े बायोफिल्म को SYTO9 और प्रोपिडियम आयोडाइड रंगों से रंगा जाता है, धोया जाता है, फिर कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना की जाती है।
Introduction
एसिनेटोबैक्टर को नोसोकोमियल संक्रमण का कारण माना जाता है, और इसका मानव संक्रमण, विशेष रूप से स्वास्थ्य सुविधाओं में, तेजीसे रिपोर्ट किया जाता है। यह अस्पतालों, स्वास्थ्य सुविधाओं और भोजन से जुड़े वातावरण 2,3,4 में व्यापक है। यह अस्पताल की सतहों जैसे बिस्तर रेल, बेडसाइड टेबल, वेंटिलेटर की सतह और सिंकसहित वातावरण में लंबे समय तक जीवित रह सकता है। पर्यावरणीय सतहों पर इस तरह की दृढ़ता एसिनेटोबैक्टर4 के नोसोकोमियल संक्रमण में योगदान देने वाले महत्वपूर्ण कारकों में से एक हो सकती है।
बायोफिल्म माइक्रोबियल जीवन का एक रूप है और एक माइक्रोबियल मैट्रिक्स है जो जीवित माइक्रोबियल कोशिकाओंऔर कोशिकाओं से बाह्य बहुलक पदार्थों (ईपीएस) से बना है। माइक्रोबियल कोशिकाएं मैट्रिक्स में एम्बेडेड होती हैं और अक्सर पर्यावरणीय तनाव जैसे गर्मी, लवण, सूखापन, एंटीबायोटिक्स, कीटाणुनाशक और कतरनी बलों 6,7 के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी होती हैं।
एसिनेटोबैक्टर सतहों पर बायोफिल्म बना सकता है, यह सुझाव देता है कि यह अस्पताल की सतहों सहित पर्यावरणीय सतहों पर विस्तारित अस्तित्व में योगदान दे सकता है, और एंटीबायोटिक उपचार के लिए प्रतिरोध 8,9 को बढ़ा सकता है। इसके अलावा, एसिनेटोबैक्टर का बायोफिल्म गठन मानव नैदानिक परिणामों के साथ अत्यधिक जुड़ा हो सकताहै। इसलिए, एसिनेटोबैक्टर उपभेदों की बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी पर्यावरणीय अस्तित्व और मानव संक्रमण 8,10 की भविष्यवाणी करने में संकेतकों में से एक हो सकती है।
सतह से जुड़े बायोफिल्म को बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी का आकलन करने के लिए परिमाणित और कल्पना की जा सकती है। सतह से जुड़े बायोफिल्म की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बायोफिल्म को आमतौर पर क्रिस्टल वायलेट जैसे बायोफिल्म-धुंधला रंगों से दाग दिया जाता है, और रंगों को घोल में संश्लेषित किया जाता है और ऑप्टिकल घनत्व11 के लिए मापा जाता है। बायोफिल्मफॉर्मेबिलिटी का आकलन करने के लिए बायोफिल्म का विज़ुअलाइज़ेशन एक और अच्छा तरीका है। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) विज़ुअलाइज़ेशन विधि फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके विशिष्टता को नियोजित करती है, एसईएम12,13 जैसी अन्य तकनीकों की तुलना में बायोफिल्म आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए अधिक उपयोगी हो सकती है।
बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं को बायोफिल्म11 में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए गिना जा सकता है। बायोफिल्म में एम्बेडेड व्यवहार्य कोशिकाओं को अलग किया जाता है, पतला किया जाता है, अगर प्लेटों पर फैलाया जाता है, इनक्यूबेट किया जाता है, और गणना की जाती है। क्योंकि कोशिकाओं की अधिक संख्या संक्रामक खुराक को पूरा करने की संभावना है, यह बायोफिल्म पर अधिक विस्तृत जानकारी प्रदान कर सकता है, जैसे कि कोशिकाओं की संख्या13,14 से जुड़े संक्रमण क्षमता।
यह लेख चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है (1) सतह से जुड़े बायोफिल्म की मात्रा निर्धारित करना, (2) बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करना, और (3) एसिनेटोबैक्टर के सीएलएसएम का उपयोग करके बायोफिल्म की कल्पना करना। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एसिनेटोबैक्टर आइसोलेट्स की बायोफिल्म फॉर्मेबिलिटी का आकलन करने और उनके बायोफिल्म को चिह्नित करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, अलग-अलग डिग्री के साथ एसिनेटोबैक्टर आइसोलेट्स के बायोफिल्म गठन को मापा गया, कल्पना की गई, और बायोफिल्म में व्यवहार्य कोशिकाओं का अनुमान लगाया गया (चित्रा 1, चित्र?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह शोध कोरिया खाद्य अनुसंधान संस्थान (केएफआरआई) के मुख्य अनुसंधान कार्यक्रम (E0210702-03) द्वारा समर्थित था, जो विज्ञान और आईसीटी मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित था।
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
Riferimenti
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
