Kvantifisering, levedyktighetsvurdering og visualiseringsstrategier for Acinetobacter biofilmer
Summary
Denne protokollen beskriver fremstillingen av inokulumet, biofilmkvantifiseringen på mikrotiterplater ved bruk av krystallfiolett fargestoff, levedyktig telling i biofilmer og visualisering av biofilmer av Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter forårsaker nosokomiale infeksjoner, og biofilmdannelsen kan bidra til overlevelse på tørre overflater som sykehusmiljøer. Dermed er biofilmkvantifisering og visualisering viktige metoder for å vurdere potensialet til Acinetobacter-stammer for å forårsake nosokomiale infeksjoner. Biofilmene som dannes på overflaten av mikroplaten kan kvantifiseres når det gjelder volum og cellenummer. Biofilmvolumer kan kvantifiseres ved farging med krystallfiolett, vasking, avfarging ved bruk av etanol, og deretter måle det oppløselige fargestoffet ved hjelp av en mikroplateleser. For å kvantifisere antall celler som er innebygd i biofilmene, blir biofilmene skrapt av ved hjelp av celleskrapere, høstet i saltvannet, kraftig omrørt i nærvær av glassperler og spredt på Acinetobacter-agar. Deretter inkuberes platene ved 30 °C i 24-42 timer. Etter inkubering er de røde koloniene oppregnet for å estimere antall celler i biofilmer. Denne levedyktige tellemetoden kan også være nyttig for å telle Acinetobacter-celler i biofilm med blandede arter. Acinetobacter biofilmer kan visualiseres ved hjelp av fluorescerende fargestoffer. En kommersielt tilgjengelig mikroplate designet for mikroskopisk analyse brukes til å danne biofilmer. Deretter blir de bunnflatefestede biofilmene farget med SYTO9 og propidiumjodidfarger, vasket og deretter visualisert med konfokal laserskanningsmikroskopi.
Introduction
Acinetobacter er kjent for å forårsake nosokomiale infeksjoner, og dets menneskelige infeksjon, spesielt i helseinstitusjoner, rapporteres i økende grad1. Det er utbredt på sykehus, helseinstitusjoner og matassosierte miljøer 2,3,4. Den kan overleve i lang tid i miljøer, inkludert sykehusoverflater som sengeskinner, nattbord, overflaten på ventilatorer og vasker4. Slik persistens på miljøoverflater kan være en av de viktigste faktorene som bidrar til nosokomiale infeksjoner av Acinetobacter4.
Biofilm er en form for mikrobielt liv og er en mikrobiell matrise sammensatt av levende mikrobielle celler og ekstracellulære polymere stoffer (EPS) fra cellene5. De mikrobielle cellene er innebygd i matrisen og er ofte svært motstandsdyktige mot miljøbelastninger som varme, salter, tørrhet, antibiotika, desinfeksjonsmidler og skjærkrefter 6,7.
Acinetobacter kan danne biofilm på overflater, noe som tyder på at det kan bidra til utvidet overlevelse på miljøoverflater, inkludert sykehusoverflater, og økt motstand mot antibiotikabehandling 8,9. I tillegg kan biofilmdannelsen av Acinetobacter være sterkt assosiert med humane kliniske utfall8. Derfor kan biofilmformbarheten til Acinetobacter-stammer være en av indikatorene for å forutsi miljøoverlevelse og menneskelige infeksjoner 8,10.
De overflatefestede biofilmene kan kvantifiseres og visualiseres for å vurdere formbarheten av biofilm. For å kvantifisere overflatefestede biofilmer, blir biofilmene normalt farget av biofilmfargestoffer som krystallfiolett, og fargestoffene elueres i oppløsning og måles for optisk tetthet11. Visualisering av biofilm er en annen god tilnærming for å vurdere biofilmens formbarhet11. Konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) visualiseringsmetode som bruker spesifisitet ved bruk av fluorescerende fargestoffer, kan være mer nyttig for å karakterisere biofilmmorfologi sammenlignet med andre teknikker som SEM12,13.
De levedyktige cellene i biofilm kan telles for å estimere antall levedyktige celler i biofilm11. De levedyktige cellene innebygd i biofilmer er frittstående, fortynnet, spredt på agarplater, inkubert og oppregnet. Fordi det høyere antall celler sannsynligvis vil møte den smittsomme dosen, kan den gi mer detaljert informasjon om biofilmer, for eksempel infeksjonspotensialer forbundet med antall celler13,14.
Denne artikkelen presenterer trinnvise protokoller for å (1) kvantifisere overflatefestede biofilmer, (2) telle levedyktige celler i biofilmene, og (3) visualisere biofilmene ved hjelp av CLSM av Acinetobacter. De presenterte protokollene beskriver metodene for å vurdere biofilmformbarheten til Acinetobacter-isolater og karakterisere deres biofilmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjelp av den beskrevne protokollen ble biofilmdannelsen av Acinetobacter-isolater i varierende grad målt, visualisert, og de levedyktige cellene i biofilmene ble estimert (figur 1, figur 2 og figur 3).
I denne protokollen ble det brukt to forskjellige temperaturer, 30 °C for vekst og 25 °C for biofilmdannelse av Acinetobacter. 30 °C ble brukt fordi mange studier brukte mer enn 30…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av hovedforskningsprogrammet (E0210702-03) fra Korea Food Research Institute (KFRI), finansiert av departementet for vitenskap og IKT.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
Riferimenti
- Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).
- Carvalheira, A., Silva, J., Teixeira, P. Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review. Food Microbiology. 95, 103675 (2021).
- Towner, K. J. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. Journal of Hospital Infection. 73 (4), 355-363 (2009).
- Weber, D. J., Rutala, W. A., Miller, M. B., Huslage, K., Sickbert-Bennett, E. Role of hospital surfaces in the transmission of emerging health care-associated pathogens: Norovirus, Clostridium difficile, and Acinetobacter species. American Journal of Infection Control. 38 (5), S25-S33 (2010).
- Flemming, H. C., et al. The biofilm matrix: multitasking in a shared space. Nature Reviews Microbiology. 21 (2), 70-86 (2023).
- Flemming, H. C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 563-575 (2016).
- Yin, W., Wang, Y., Liu, L., He, J. Biofilms: the microbial "protective clothing" in extreme environments. International Journal of Molecular Sciences. 20 (14), 3423 (2019).
- Gedefie, A., et al. Acinetobacter baumannii biofilm formation and its role in disease pathogenesis: a review. Infection and drug resistance. 14, 3711-3719 (2021).
- Whiteway, C., Breine, A., Philippe, C., Van der Henst, C. Acinetobacter baumannii. Trends in Microbiology. 30 (2), 199-200 (2022).
- Longo, F., Vuotto, C., Donelli, G. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii. New Microbiologica. 37 (2), 119-127 (2014).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Jia, J., Xue, X., Guan, Y., Fan, X., Wang, Z. Biofilm characteristics and transcriptomic profiling of Acinetobacter johnsonii defines signatures for planktonic and biofilm cells. Environmental Research. 213, 113714 (2022).
- Yang, C., Su, P., Moi, S., Chuang, L. Biofilm formation in Acinetobacter baumannii: genotype-phenotype correlation. Molecules. 24 (10), 1849 (2019).
- Alamri, A. M., Alsultan, A. A., Ansari, M. A., Alnimr, A. M. Biofilm-formation in clonally unrelated multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates. Pathogens. 9 (8), 630 (2020).
- Lim, E. S., Nam, S. J., Koo, O. K., Kim, J. S. Protective role of Acinetobacter and Bacillus for Escherichia coli O157:H7 in biofilms against sodium hypochlorite and extracellular matrix-degrading enzymes. Food Microbiology. 109, 104125 (2023).
- Stepanović, S., Ćirković, I., Ranin, L., Svabić-Vlahović, M. Biofilm formation by Salmonella spp. and Listeria monocytogenes on plastic surface. Letters in Applied Microbiology. 38 (5), 428-432 (2004).
- Boone, R. L., et al. Analysis of virulence phenotypes and antibiotic resistance in clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated in Nashville, Tennessee. BMC Microbiology. 21 (1), 21 (2021).
- Otter, J. A., et al. Surface-attached cells, biofilms and biocide susceptibility: implications for hospital cleaning and disinfection. Journal of Hospital Infection. 89 (1), 16-27 (2015).
- Ravishankar, S., Juneja, V. K., Yousef, A. E., Juneja, V. K. Adaptation or resistance responses of microorganisms to stresses in the food processing environment. Microbial Stress Adaptation and Food Safety. , (2003).
- Dewanti, R., Wong, A. C. L. Influence of culture conditions on biofilm formation by Escherichia coli O157:H7. International Journal of Food Microbiology. 26 (2), 147-164 (1995).
- McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiology Reviews. 37 (2), 130-155 (2013).
- McQueary, C. N., Actis, L. A. Acinetobacter baumannii biofilms: variations among strains and correlations with other cell properties. The Journal of Microbiology. 49 (2), 243-250 (2011).
