Quantificação, Avaliação de Viabilidade e Estratégias de Visualização para Biofilmes de Acinetobacter
Summary
Este protocolo descreve a preparação do inóculo, a quantificação do biofilme em placas de microtitulação usando corante violeta cristal, a contagem viável em biofilmes e a visualização de biofilmes de Acinetobacter.
Abstract
Acinetobacter causa infecções hospitalares e sua formação de biofilme pode contribuir para a sobrevivência em superfícies secas, como ambientes hospitalares. Assim, a quantificação e visualização do biofilme são métodos importantes para avaliar o potencial de cepas de Acinetobacter em causar infecções nosocomiais. Os biofilmes que se formam na superfície da microplaca podem ser quantificados em termos de volume e número de células. Os volumes de biofilme podem ser quantificados pela coloração usando violeta de cristal, lavagem, coloração usando etanol e, em seguida, medindo o corante solubilizado usando um leitor de microplacas. Para quantificar o número de células embutidas nos biofilmes, os biofilmes são descartados com raspadores celulares, colhidos em solução salina, agitados vigorosamente na presença de esferas de vidro e espalhados em ágar Acinetobacter. Em seguida, as placas são incubadas a 30 °C por 24-42 h. Após a incubação, as colônias vermelhas são enumeradas para estimar o número de células em biofilmes. Este método de contagem viável também pode ser útil para a contagem de células de Acinetobacter em biofilmes de espécies mistas. Biofilmes de Acinetobacter podem ser visualizados usando corantes fluorescentes. Uma microplaca comercialmente disponível projetada para análise microscópica é empregada para formar biofilmes. Em seguida, os biofilmes aderidos à superfície inferior são corados com SYTO9 e iodeto de propídio, lavados e, em seguida, visualizados com microscopia confocal de varredura a laser.
Introduction
Sabe-se que a Acinetobacter causa infecções nosocomiais é cada vez mais relatada1. Está disseminada em hospitais, serviços de saúde e ambientes associados à alimentação 2,3,4. Pode sobreviver por um longo período em ambientes que incluem superfícies hospitalares, como grades de cama, mesas de cabeceira, superfície de ventiladores e pias4. Essa persistência nas superfícies ambientais pode ser um dos fatores significativos que contribuem para as infecções nosocomiais de Acinetobacter4.
O biofilme é uma forma de vida microbiana e é uma matriz microbiana composta por células microbianas vivas e substâncias poliméricas extracelulares (EPS) provenientes das células5. As células microbianas estão embutidas na matriz e são frequentemente altamente resistentes a estresses ambientais como calor, sais, secura, antibióticos, desinfetantes e forças de cisalhamento 6,7.
Acinetobacter pode formar biofilmes em superfícies, sugerindo que pode contribuir para maior sobrevida em superfícies ambientais, incluindo superfícies hospitalares, e maior resistência ao tratamento com antibióticos 8,9. Além disso, a formação de biofilme de Acinetobacter poderia estar altamente associada a desfechos clínicos humanos8. Portanto, a formabilidade do biofilme de cepas de Acinetobacter pode ser um dos indicadores na predição de sobrevivência ambiental e infecções humanas 8,10.
Os biofilmes aderidos à superfície podem ser quantificados e visualizados para avaliar a formabilidade do biofilme. Para quantificar os biofilmes aderidos à superfície, os biofilmes são normalmente corados por corantes corantes de biofilme, como o violeta de cristal, e os corantes são eluídos em solução e medidos quanto à densidade óptica11. A visualização de biofilmes é outra boa abordagem para avaliar a conformabilidade do biofilme11. O método de visualização por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) empregando especificidade usando corantes fluorescentes poderia ser mais útil para caracterizar a morfologia do biofilme em comparação com outras técnicas, como aMEV12,13.
As células viáveis em biofilmes podem ser contadas para estimar o número de células viáveis em biofilmes11. As células viáveis embutidas em biofilmes são destacadas, diluídas, espalhadas em placas de ágar, incubadas e enumeradas. Como o maior número de células provavelmente atenderá à dose infecciosa, ele pode fornecer informações mais detalhadas sobre os biofilmes, como os potenciais de infecção associados ao número de células13,14.
Este artigo apresenta protocolos passo a passo para (1) quantificar biofilmes aderidos à superfície, (2) contar células viáveis nos biofilmes e (3) visualizar os biofilmes usando CLSM de Acinetobacter. Os protocolos apresentados descrevem os métodos para avaliar a conformabilidade do biofilme de isolados de Acinetobacter e caracterizar seus biofilmes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando o protocolo descrito, a formação de biofilme de isolados de Acinetobacter com graus variados foi medida, visualizada e as células viáveis nos biofilmes foram estimadas (Figura 1, Figura 2 e Figura 3).
Neste protocolo, foram utilizadas duas diferentes temperaturas, 30 °C para o crescimento e 25 °C para a formação do biofilme de Acinetobacter. 30 °C foi utilizado porque mui…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Principal de Pesquisa (E0210702-03) do Korea Food Research Institute (KFRI), financiado pelo Ministério da Ciência e TIC.
Materials
| 96-well cell culture plate | SPL | 30096 | Polystyrene 96-well plate |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | Merck KGaA | 1.10493.0500 | |
| Blood Agar Base Plate | KisanBio | MB-B1005-P50 | Growth media for Acinetobacter |
| CHROMagar Acinetobacter | CHROMagar | AC092 | Selective plate for Acinetobacter |
| Crystal violet solution | Sigma-Aldrich | V5265 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit | Invitrogen | L10316 | SYTO9 and propidium iodide |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO NanoQuant | Biofilm measurement |
| RBC Glass Plating Beads | RBC | RG001 | Glass beads |
| μ-Plate 96 Well Black | ibidi | 89621 | Microplate intended for CLSM |
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