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Articolo metodologico

Test della trombosi venosa in un modello murino di cancro

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DOI:

10.3791/65518

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5 gennaio 2024

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1Renal Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 2Vascular Biology Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 3Division of Interventional Radiology, Department of Radiology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 4Department of Medicine, Whitaker Cardiovascular Institute, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 5Department of Biochemistry and Cell Biology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 6Veterans Affairs Boston Healthcare System, 7Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology, 8Center of Cross-Organ Vascular Pathology, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University

In questo articolo

Sommario

Questo articolo ha lo scopo di presentare un metodo ottimizzato per la valutazione della trombosi venosa in un modello murino di cancro, utilizzando clip vascolari per ottenere la legatura venosa. L'ottimizzazione riduce al minimo la variabilità nelle misurazioni correlate alla trombosi e migliora la rilevanza per la trombosi venosa umana associata al cancro.

Abstract

Questo documento metodologico evidenzia le sfumature chirurgiche di un modello di trombosi venosa di roditore, in particolare nel contesto della trombosi associata al cancro (TAC). La trombosi venosa profonda è una complicanza comune nei sopravvissuti al cancro e può essere potenzialmente fatale. Gli attuali modelli di trombosi venosa murina comportano in genere un'occlusione meccanica completa o parziale della vena cava inferiore (IVC) utilizzando una sutura. Questa procedura induce una stasi totale o parziale del sangue e un danno endoteliale, innescando la trombogenesi. I modelli attuali presentano limitazioni come una maggiore variabilità nel peso dei coaguli, un tasso di mortalità significativo e una curva di apprendimento prolungata. Questo rapporto introduce perfezionamenti chirurgici utilizzando clip vascolari per affrontare alcune di queste limitazioni. Utilizzando un modello murino di xenotrapianto di cancro del colon singenico, abbiamo impiegato clip vascolari personalizzate per legare la vena cava infrarenale. Queste clip consentono uno spazio residuo per le labbra simile a una sutura in polipropilene 5-0 dopo le legature IVC. I topi con il metodo di sutura sono serviti come controlli. Il metodo della clip vascolare ha portato a un'occlusione vascolare parziale riproducibile e costante e a un peso del coagulo maggiore con una minore variabilità rispetto al metodo di sutura. Ci si aspettava che i pesi del coagulo maggiori, la maggiore massa del coagulo e il coagulo della superficie luminale dell'IVC fossero dovuti al profilo di pressione più elevato delle clip vascolari rispetto a una sutura in polipropilene 6-0. L'approccio è stato convalidato dall'ecografia in scala di grigi, che ha rivelato una massa di coaguli costantemente maggiore nella vena cava infrarenale con clip vascolari rispetto al metodo di sutura. Queste osservazioni sono state ulteriormente confermate dalla colorazione in immunofluorescenza. Questo studio offre un metodo migliorato per generare un modello di trombosi venosa nei topi, che può essere impiegato per approfondire la comprensione meccanicistica della CAT e nella ricerca traslazionale come la scoperta di farmaci.

Introduzione

Tromboembolia venosa associata al cancro (TEV)
Il rischio di tromboembolia venosa (TEV) è da 4 a 7 volte più alto nei sopravvissuti al cancro rispetto alla popolazione generale 1,2,3. Questa condizione si rivela fatale in un paziente su sette con cancro. L'incidenza di TEV varia a seconda del tipo di tumore e del carico tumorale ed è più alta tra i pazienti con tumori del pancreas e dello stomaco4.

Il TEV associato al cancro nei pazienti oncologici ha un significato prognostico. È associata a una sopravvivenza globale sfavorevole nel primo anno dopo una diagnosi di cancro, anche dopo aggiustamento per età, razza e stadio del cancro sottostante5. Questi risultati evidenziano l'importanza di esaminare il TEV associato al cancro e la necessità di sondare il suo meccanismo utilizzando un modello animale. La rilevanza traslazionale di quest'area è ulteriormente enfatizzata dal fatto che il TEV nei pazienti oncologici è prevenibile e curabile con la tromboprofilassi e la terapia antitrombotica6.

Modelli animali di cancro e trombosi venosa
I modelli di cancro sono convenzionalmente chiamati xenotrapianti, che comportano l'iniezione di cellule tumorali nei topi. L'iniezione di cellule tumorali in un sito come la sua origine è indicata come modello ortotopico, mentre in un sito diverso (piano sottocutaneo sul fianco) è nota come modello eterotopico. La specie di origine delle cellule tumorali le determina come modello allogenico, come la linea cellulare HT-29 (cancro del colon umano)7,8,9. Al contrario, i modelli singetici utilizzano le linee cellulari tumorali murine, comprese le linee cellulariRenCa e MC-38 3,10.

La letteratura ha descritto modelli di trombosi arteriosa, venosa e capillare nei roditori. La trombosi venosa è indotta nella vena cava inferiore (IVC) da una lesione meccanica (filo guida) o da una legatura IVC completa, chimica (cloruro ferrico) o da una lesione elettrolitica. La trombosi indotta da cloruro ferrico o la legatura IVC rappresentano modelli di occlusione completa. Quest'ultimo provoca la stasi del sangue e infiltrati infiammatori nelle vene11,12,13. Il modello completo di legatura determina un alto tasso di formazione di trombosi nel 95-100% dei topi. Il modello di legatura parziale dell'IVC potrebbe includere l'interruzione dei rami ileolombari laterali e il ritorno venoso viene abrogato applicando legature di sutura nei punti target distali dell'IVC12. A volte, un supporto di spazio viene utilizzato per interrompere parzialmente il ritorno venoso. Tuttavia, il peso del trombo è incoerente nell'attuale modello di occlusione parziale, con conseguente elevata variabilità nei pesi e nelle altezze dei coaguli12,14.

Entrambi questi modelli meccanici a vena larga (parziale e completa) hanno dei limiti. In primo luogo, la legatura IVC (modello di stasi) spesso provoca ipotensione. Il sangue viene deviato attraverso le vene vertebrali. Anche se in mani esperte, la mortalità con questo modello varia dal 5% al 30%, con il tasso più alto previsto durante la curva di apprendimento. È importante sottolineare che il modello di occlusione completa non riproduce la trombosi venosa profonda (TVP) nell'uomo, dove un trombo è tipicamente non occlusivo. L'occlusione completa può alterare i fattori emorrologici e i parametri farmacodinamici, alterando la biodisponibilità dei composti nel sito locale. A causa di queste limitazioni, i modelli di occlusione completa potrebbero non essere ottimali per testare nuovi composti chimici per scopi terapeutici e scoperte farmacologiche12.

Va notato che per fornire un modello murino di trombosi venosa clinicamente più rilevante con flusso ridotto con danno endoteliale, è stato introdotto un modello di trombosi venosa, in cui la TVP è innescata dalla restrizione del flusso sanguigno in assenza di interruzione endoteliale. Il modello è stato validato mediante microscopia elettronica a scansione15. Un modello di trombosi clinicamente rilevante preferito è quello con trombosi quasi completa che consente la scoperta di farmaci. La formazione di coaguli negli attuali modelli di occlusione parziale è incoerente, con conseguente elevata variabilità nel peso e nell'altezza del coagulo12,16. Inoltre, il peso del coagulo è variabile con i metodi convenzionali, richiedendo più topi per studio12.

I precedenti modelli di trombosi associata al cancro si concentravano sul cancro del colon, del pancreas e del polmone ed erano tutti modelli di occlusione completa17,18,19. Questo manoscritto modifica il modello di trombosi a occlusione parziale per fornire coaguli con minore variabilità e mortalità nei topi (Figura 1). Studi precedenti hanno utilizzato linee cellulari tumorali allogeniche su topi atimici immunocompromessi 19,20,21. Questo manoscritto utilizza uno xenotrapianto di cellule singegene MC-38 in topi C57Bl6/J, che consente l'uso di topi immunocompetenti e l'esame delle componenti immunitarie per la trombogenesi.

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Protocollo

Per questo studio sono stati utilizzati 16 topi femmina C57Bl6/J, di età compresa tra 8 e 12 settimane e con un peso corporeo compreso tra 20 e 25 g. I topi sono stati alloggiati in condizioni standard e sono stati nutriti con cibo e acqua ad libitum. Questo studio è stato condotto con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Boston University. Le procedure aperte qui descritte sono state eseguite in condizioni sterili.

1. Modello di xenotrapianto

  1. Colture cellulari
    1. Prima dell'impianto sottocutaneo eterotopico, far crescere le cellule MC-38 come monostrato fino all'80% di confluenza.
    2. Dopo tripsinizzazione e risospensione in terreni contenenti FBS al 10%, centrifugare le cellule a 277 x g, 4 °C per 5 min. Quindi, risospendere le cellule in terreni privi di siero a una concentrazione di 1 x 104 cellule MC-38/μL di terreno privo di siero.
      1. Per la tripsinizzazione, coltivare le cellule MC-38 fino a raggiungere una confluenza desiderata (di solito intorno al 70%-80%) e quindi aspirare il terreno di coltura dalla piastra di Petri.
      2. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA e incubare le cellule con tripsina per 1 minuto a 37 °C per consentire il distacco. Picchiettare o scuotere delicatamente la capsula di Petri per garantire un distacco uniforme.
      3. Aggiungere un terreno di coltura contenente siero o un inibitore della tripsina per neutralizzare l'attività e prevenire un'ulteriore dissociazione cellulare. Raccogliere le cellule staccate insieme alla soluzione di tripsina neutralizzata.
      4. Per la risospensione, una volta che le cellule sono state staccate attraverso la tripsinizzazione, prepararle per il trapianto o ulteriori esperimenti. Centrifugare la sospensione cellulare raccolta a 277 x g per pellettizzare le cellule.
      5. Rimuovere con cautela il surnatante (liquido sopra il pellet cellulare). Aggiungere 9 mL di terreno di coltura, tampone o soluzione al pellet cellulare per ottenere la concentrazione cellulare desiderata per il trapianto o la sperimentazione.
      6. Risospendere delicatamente le cellule pipettando su e giù o utilizzando un agitatore per matracci di coltura. Evitare pipettaggi vigorosi che potrebbero danneggiare le cellule.
        NOTA: A seconda della variante o della linea cellulare utilizzata, le cellule possono essere risospese in un rapporto 1:1 di matrice di membrana basale solubilizzata e terreni privi di siero per rallentare la crescita e la diffusione di cellule di topo altamente aggressive dopo l'impianto. Tutte le fasi della coltura cellulare devono essere eseguite in una cappa asettica completa in uno spazio appositamente assegnato alla coltura cellulare e devono essere testate regolarmente per il micoplasma.
    3. Contare le celle con un contatore di cellule automatizzato secondo il protocollo manuale fornito.
  2. Impianto cellulare
    1. Assegnare in modo casuale otto topi al gruppo sperimentale e otto topi al gruppo di controllo come segue. Nel gruppo di controllo, utilizzare topi con xenotrapianto MC38 ed eseguire la legatura IVC con una sutura 5-0 in polipropilene. Nel gruppo sperimentale, utilizzare topi con xenotrapianto MC38 ed eseguire la legatura IVC con una clip vascolare personalizzata.
    2. Posiziona il mouse in decubito laterale sinistro e radi il lato destro tra gli arti anteriori e posteriori. Applicare alcol e iodio lungo la zona lombare dorsale per preparare in modo asettico l'area per l'iniezione.
    3. Iniettare 2 x 106 cellule MC-38 preparate in 200 μL di terreno per via sottocutanea nel fianco, a metà strada tra la costola più distale dell'animale e l'eminenza pelvica utilizzando un ago da 27 G tenendo l'animale delicatamente nella mano non dominante.
    4. Dopo l'iniezione, ispezionare attentamente gli animali e rimetterli nella gabbia. Gli animali devono essere ispezionati per quanto segue: 1. Cambiamenti nel comportamento, nei livelli di attività e nella mobilità generale dei topi. Eventuali cambiamenti significativi potrebbero indicare disagio o problemi di salute. 2. Le condizioni fisiche generali dei topi, compresa la qualità del pelo, le abitudini di toelettatura e qualsiasi segno visibile di sofferenza o anomalie 3. Ritorno al consumo di cibo e all'assunzione di acqua 4. Qualsiasi cambiamento nel loro livello di attività, postura o interazioni con i compagni di gabbia. La letargia o l'aumento dell'aggressività potrebbero essere segni di angoscia.

2. Follow-up della crescita tumorale

  1. Monitorare gli animali su base bisettimanale per le tendenze di crescita del tumore per 3-4 settimane. Misurare i tumori con un calibro e registrare le dimensioni del tumore.
    1. Misurare i tumori lungo l'asse più lungo (L) e l'asse perpendicolare all'asse lungo (W). Calcolare il volume del tumore (V) utilizzando l'equazione L x (W2) = V. Se la dimensione del tumore supera i 20 mm in ciascuna dimensione e/o il tumore presenta segni di ulcerazione, sopprimere gli animali prima della fine dell'esperimento.
  2. Una volta che il volume del tumore raggiunge i 400 mm3, pianificare l'utilizzo dei topi per la legatura IVC.

3. Anestesia e preparazione

  1. Anestetizzare il topo in una camera di isoflurano e iniettare l'analgesico per via sottocutanea: tenere l'animale dalla base della coda. Tenere l'animale sulla superficie del dorso della mano non dominante.
  2. Trasferire l'animale nella camera di induzione dell'anestetico continuo riempita con isoflurano al 3%-4%. Confermare un'adeguata anestesia generale con l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi. Utilizzare una dose di mantenimento di isoflurano all'1%-3%. Applicare l'unguento veterinario su entrambi gli occhi.
  3. Iniezione sottocutanea con buprenorfina (oppioide per attenuare il dolore): sciogliere la scorta di buprenorfina a una concentrazione di 0,3 mg/mL in cloruro di sodio (NaCl) allo 0,9% per raggiungere la concentrazione di 0,03 mg/mL.
  4. Iniettare un dosaggio di 0,05-0,1 mg/kg di buprenorfina 0,03 mg/mL insieme a 500 μL di NaCl sterile allo 0,9% per via sottocutanea prima dell'intervento chirurgico. In un topo da 20 g è necessaria una quantità di 2 μg o 66 μL di 0,03 mg/mL di buprenorfina.
  5. Preparazione della pelle: Posizionare il topo completamente anestetizzato in posizione supina sopra la coperta riscaldante. Disinfettare la zona addominale anteriore con tintura di clorexidina allo 0,5%, 2 volte. Controllare frequentemente la temperatura della coperta riscaldante durante la procedura e assicurarsi che la temperatura non scenda.

4. Legatura IVC

  1. Laparotomia della linea mediana
    1. Incidere la cute addominale con delle forbici sottili partendo dall'eminenza xifoidea fino alla vescica. Pizzicare il peritoneo a metà dell'incisione cutanea con una pinza atraumatica. Garantire uno spazio adeguato tra l'incisione e l'intestino sovrastante (Figura 2A).
    2. Aprire il peritoneo in modo longitudinale insieme alla linea alba avascolare.
  2. Esternalizzazione dell'intestino sul lato addominale destro
    1. Tira l'intestino con le punte di cotone bagnate. Coprire l'intestino con una garza sterile completamente umida. Assicurarsi che l'intestino coperto sia in una direzione priva di trazione, senza alcuna trazione eccessiva sui vasi mesenterici.
  3. Esposizione completa dell'IVC e dei rami, compresa la confluenza della vena renale sinistra all'IVC (Figura 2B).
    1. Far cadere 200-300 μL di soluzione fisiologica normale. Esplorare il decorso degli ureteri, dell'IVC, dell'aorta e delle vene renali (Figura 2).
  4. Piano avascolare nel punto di confluenza dell'IVC infra-renale e della confluenza della vena renale sinistra.
    1. Passare delicatamente la sutura in polipropilene 6-0 attraverso il piano avascolare 2x-3x con movimenti da caudali a cefalici con la pinza atraumatica a punta chiusa.
    2. Assicurarsi che qualsiasi minima trasudazione sia controllata con una leggera pressione fornita con un tamponamento con punta di cotone. Allargare il piano fornito facendo passare la sutura in polipropilene 6-0 con delicati movimenti caudali e cranici.
  5. Cauterizzazione dei rami gonadici e lombari (Figura 2D)
    1. Potrebbero essere presenti fino a 4 rami posteriori o lombari. Per evitare potenziali complicanze di ischemia spinale e claudicatio, lasciare intatti i rami lombari nel protocollo attuale.
    2. Verificare che siano presenti da 2 a 3 rami laterali, compreso l'apporto arterioso bilaterale del corno uterino e i vasi ipogastrici. Garantire un'interruzione coerente delle prime diramazioni presenti bilateralmente. Cauterizzare i rami bilaterali appena distali alla confluenza della vena renale sinistra e dell'IVC (IVC infra-renale). Assicurarsi che i vasi di drenaggio venoso del corno uterino non siano ostruiti.
      NOTA: Si opta per la cauterizzazione del ramo laterale perché questo metodo fornisce una superficie liscia e ininterrotta, riducendo qualsiasi potenziale di sanguinamento incontrollato. Inoltre, la cauterizzazione è più veloce e fattibile rispetto alla legatura della sutura con suture 10-0. Pertanto, gli animali saranno esposti a una procedura più breve e più sicura.
  6. Ricontrollare il decorso degli ureteri e la vascolarizzazione per assicurarsi che non vi siano trasudazioni o cauterizzazione involontaria (Figura 2C).
  7. Legatura IVC con clip vascolari nel gruppo sperimentale
    1. Personalizza le clip vascolari con una larghezza di sutura in nylon 2-0 con pinze atraumatiche. Applicare le clip vascolari personalizzate nel gruppo sperimentale circonferenzialmente intorno all'IVC infrarenale.
    2. Applicare le clip vascolari sulla sutura. Il passaggio di sutura primario fornisce un piano avascolare sufficiente con due o tre movimenti caudali e cranici meticolosi (Figura 2E-F).
    3. Passare ulteriormente le clip vascolari attraverso il piano preparato. Preparare il piano alla confluenza della vena renale sinistra e dell'IVC sufficientemente largo da consentire un passaggio della clip senza incidenti (Figura 2E).
    4. Posizionare la clip vascolare personalizzata orizzontalmente, perpendicolarmente al corso IVC, attraverso il piano preparato. Posizionare le clip vascolari sopra la sutura in polipropilene 5-0 per garantire un adeguato spazio rimanente (Figura 2G).
    5. Assicurarsi che i passaggi precedenti vengano eseguiti delicatamente per evitare danni ai vasi o sanguinamenti nel sito delle clip vascolari. Osservare il campo operatorio per la potenziale trasudazione. Applicare una leggera pressione con la punta di cotone sul campo operatorio in caso di trasudamento.
  8. Legatura IVC con sutura nel gruppo di controllo
    1. Legatura della sutura con sutura in polipropilene 6-0. Eseguire una sutura chirurgica a nodo quadrato attorno all'IVC infra-renale nel piano preparato su una sutura di seta 5-0.
    2. Una volta completata la sutura, rimuovere delicatamente la sutura di seta per garantire un adeguato spazio residuo.
  9. Eseguire l'iniezione sottocutanea di 200 μL di soluzione fisiologica normale.
    NOTA: Per fornire una tecnica comparabile per l'occlusione parziale IVC con l'applicazione di una pinza, la clip vascolare è personalizzata nel presente studio per fornire spazio tra le labbra. La clip vascolare viene quindi posizionata nel piano avascolare preparato nella confluenza della vena renale sinistra e dell'IVC.
  10. Chiudere la laparotomia con la sutura vicralica 4-0 a esecuzione continua.

5. Follow-up dopo l'intervento chirurgico indice

  1. Monitorare l'animale continuamente dopo l'operazione per 1 ora o fino a quando l'equilibrio e la capacità di raddrizzamento non vengono recuperati, qualunque cosa si verifichi per prima in una gabbia isolata e pulita fino a quando non si riprende completamente.
  2. Monitorare l'animale ogni giorno per 2 giorni. Se l'animale sembra angosciato, monitoralo due volte al giorno per 2 giorni. Somministrare analgesia postoperatoria e liquidi secondo il protocollo.
    1. Sciogliere la scorta di buprenorfina con una concentrazione di 0,3 mg/mL in cloruro di sodio (NaCl) allo 0,9% per ottenere la concentrazione di 0,03 mg/mL.
    2. Iniettare un dosaggio di 0,05-0,1 mg/kg di buprenorfina 0,03 mg/mL per via sottocutanea insieme a 500 μL di NaCl sterile allo 0,9%, ogni 8-12 ore durante le prime 48 ore dopo l'intervento chirurgico indice. In un topo di 20 g, sarebbero necessari 2 μg o 66 μL di buprenorfina 0,03 mg/mL.

6. Eutanasia e raccolta dell'IVC contenente il coagulo

  1. Anestetizzare il topo in una camera di isoflurano, tenere l'animale dalla base della coda e tenere l'animale sulla superficie del dorso della mano.
  2. Trasferire l'animale nella camera di induzione dell'anestetico continuo riempita con isoflurano al 3%-4%. Posizionare l'animale in posizione supina.
  3. Eseguire una lunga laparotomia della linea mediana partendo dallo xifoide fino alla vescica come descritto.
  4. Esternalizzare l'intestino sul lato destro dell'addome e prelevare l'IVC clampato distale alla biforcazione iliaca fino all'estensione dell'IVC infra-renale (Figura 2G).
  5. Dopo il prelievo del coagulo e del tumore, sopprimere l'animale con lussazione cervicale.

7. Analisi statistica

  1. Presentare l'analisi statistica come media, mediana e deviazione standard (SD) o errore standard della media (SEM), 25° o 75° percentile o l'intero intervallo di valori, compresi i valori minimi e massimi, a seconda dei casi. Esegui un test t di Student e il test F, a seconda dei casi. Valutare la significatività statistica a livello di p <0,05.

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Risultati

A un gruppo di topi femmina C57Bl6/J, di età compresa tra 8 e 12 settimane, sono state iniettate cellule MC-38 nella fase logaritmica della crescita cellulare. Gli xenotrapianti sono cresciuti rapidamente tra la terza e la quarta settimana dopo l'iniezione18. Una volta che i tumori hanno raggiunto un volume medio di 400mm3, i topi sono stati randomizzati al gruppo di controllo e al gruppo sperimentale. Il gruppo di controllo è stato sottoposto a legatura IVC con sutura, mentre i topi sp...

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Discussione

In un modello di carcinoma del colon xenotrapianto, osserviamo una maggiore trombogenicità ed espressione di marcatori della coagulazione nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo di controllo. È importante sottolineare che la varianza in tutti questi parametri era inferiore nel gruppo sperimentale rispetto al gruppo di controllo. La modifica ha comportato l'introduzione di una clip vascolare con un profilo di pressione specifico nel punto di confluenza dell'IVC e della vena renale sinistra. La clip è stata posizionata ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione del Centro CAT-HD SFRN di AHA Cardio-oncologia SFRN 857078 (KR, VCC, XY e SL) e R01HL166608 (KR e VCC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Buprenorfina 0,3 mg/mLPAR Pharmaceutical  NDC 42023-179-05
C57BL / 6J topiThe Jackson LabIMSR_JAX:000664
CalibroVWR International, Radnor, PA12777-830
CD31AbcamAb9498
Contatore di celleMOXIEMXZ000
Morsetto Strumenti di Fine Science    13002-10
Clip ASSI. Morsetto singolo B2V, uso generale,chirurgia accurata e Strumenti scientificiPR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF PinzeStrumenti per la scienza fine11252-00
FibrinaMilliporeMABS2155-100UG
Forbici fini - Anelli grandi Strumenti perla scienza14040-10
Pinze  Strumenti per le scienze fini11002-12
Emostatico di HillStrumenti per le scienze fini13111-12
Isoflurano, USP  CovetrusNDC 11695-6777-2
MC-38 cellSigma AldrichSCC172
MicroscopioNikon Eclipse Microscopio InvertitoTE2000
Forbici  Strumenti per la scienza fine  14079-10
Sutura- VicrylAD-Chirurgico#L-G330R24
Sutura-Nylon 2-0Ethilon664H
Sutura-Prolene 5-0Ethicon8661G
Sutura-Prolene 6-0EthiconPDP127
VEV03100VisualSonicsFujiFilm
Vitrogel Matrigel MatrixIl Pozzo BioscienceVHM01 

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