Venøs tromboseanalyse i en musemodel af kræft
Summary
Denne artikel har til formål at præsentere en optimeret metode til vurdering af venøs trombose i en musekræftmodel ved hjælp af vaskulære klip for at opnå venøs ligering. Optimering minimerer variabilitet i tromboserelaterede målinger og øger relevansen for human kræftassocieret venøs trombose.
Abstract
Dette metodepapir fremhæver de kirurgiske nuancer af en gnavermodel af venøs trombose, specifikt i forbindelse med kræftassocieret trombose (CAT). Dyb venøs trombose er en almindelig komplikation hos kræftoverlevende og kan være potentielt dødelig. De nuværende murin venøse trombose modeller involverer typisk en fuldstændig eller delvis mekanisk okklusion af den ringere vena cava (IVC) ved hjælp af en sutur. Denne procedure inducerer en total eller delvis stasis af blod og endotelskader, der udløser trombogenese. De nuværende modeller har begrænsninger såsom højere variation i koagulationsvægte, betydelig dødelighed og forlænget indlæringskurve. Denne rapport introducerer kirurgiske forbedringer ved hjælp af vaskulære klip for at løse nogle af disse begrænsninger. Ved hjælp af en syngeneisk xenograft musemodel for tyktarmskræft anvendte vi tilpassede vaskulære klip til at ligere den infrarenale vena cava. Disse klip tillader resterende læbeplads svarende til en 5-0 polypropylensutur efter IVC-ligationer. Mus med suturmetoden tjente som kontrol. Den vaskulære klipmetode resulterede i en konsistent reproducerbar partiel vaskulær okklusion og større koagulationsvægte med mindre variabilitet end suturmetoden. De større koagulationsvægte, større koagulationsmasse og blodprop til IVC-luminaloverfladearealet forventedes på grund af den højere trykprofil af de vaskulære klip sammenlignet med en 6-0 polypropylensutur. Fremgangsmåden blev valideret ved gråskala ultralyd, som afslørede konsekvent større koagulationsmasse i den infrarenale vena cava med vaskulære klip sammenlignet med suturmetoden. Disse observationer blev yderligere underbygget med immunofluorescensfarvningen. Denne undersøgelse tilbyder en forbedret metode til at generere en venøs trombosemodel hos mus, som kan anvendes til at uddybe den mekanistiske forståelse af CAT og i translationel forskning såsom lægemiddelopdagelse.
Introduction
Kræftassocieret venøs tromboemboli (VTE)
Venøs tromboemboli (VTE) risiko er 4 til 7 gange højere hos kræftoverlevende sammenlignet med den generelle befolkning 1,2,3. Denne tilstand viser sig dødelig hos en ud af syv patienter med kræft. Forekomsten af VTE varierer afhængigt af kræfttypen og tumorbyrden og er højest blandt patienter med kræft i bugspytkirtlen og i maven4.
Kræftassocieret VTE hos kræftpatienter har prognostisk betydning. Det er forbundet med ugunstig samlet overlevelse i det første år efter en kræftdiagnose, selv efter justering for alder, race og stadium af underliggende kræft5. Disse resultater understreger vigtigheden af at undersøge kræftrelateret VTE og behovet for at undersøge dens mekanisme ved hjælp af en dyremodel. Den translationelle relevans af dette område understreges yderligere af, at VTE hos kræftpatienter kan forebygges og behandles med tromboprofylakse og antitrombotisk behandling6.
Dyremodeller af kræft og venøs trombose
Kræftmodeller kaldes traditionelt xenotransplantater, som indebærer injektion af kræftceller i mus. Injektion af kræftceller på et sted som dets oprindelse kaldes en ortopisk model, mens det på et andet sted (subkutant plan over flanken) er kendt som en heterotopisk model. Kræftcellernes oprindelsesart bestemmer dem som en allogen model, såsom HT-29-cellelinjen (human tyktarmskræft)7,8,9. Tværtimod bruger syngeneiske modeller murine cancercellelinjerne, herunder RenCa- og MC-38-cellelinjer 3,10.
Litteraturen har beskrevet arterielle, venøse og kapillære trombosemodeller hos gnavere. Venøs trombose induceres i den ringere vena cava (IVC) ved mekanisk skade (styretråd) eller fuldstændig IVC-ligering, kemisk (jernchlorid) eller elektrolytisk skade. Ferrichlorid-induceret trombose eller IVC-ligering repræsenterer komplette okklusionsmodeller. Sidstnævnte resulterer i stasis af blod og inflammatoriske infiltrater i vener11,12,13. Den komplette ligeringsmodel resulterer i en høj trombosedannelse hos 95% til 100% af musene. Den partielle IVC-ligeringsmodel kan omfatte afbrydelse af laterale iliolumbale grene, og den venøse tilbagevenden ophæves ved at anvende suturligationer i de distale målpunkter for IVC12. Nogle gange bruges en rumholder til at afbryde den venøse tilbagevenden delvist. Trombosevægten er imidlertid inkonsekvent i den nuværende partielle okklusionsmodel, hvilket resulterer i høj variation i koagulationsvægte og højder12,14.
Begge disse store venemekaniske modeller (delvis og komplet) har begrænsninger. For det første resulterer IVC-ligering (stasismodel) ofte i hypotension. Blodet bliver shunted gennem hvirveldyr. Selvom den er i erfarne hænder, varierer dødeligheden med denne model fra 5% -30%, med den højere sats, der forventes under læringskurven. Det er vigtigt, at den komplette okklusionsmodel ikke reproducerer dyb venetrombose (DVT) hos mennesker, hvor en trombose typisk er nonocclusive. Fuldstændig okklusion vil sandsynligvis ændre hæmorheologiske faktorer og farmakodynamiske parametre, hvilket ændrer biotilgængeligheden af forbindelser på det lokale sted. På grund af disse begrænsninger er komplette okklusionsmodeller muligvis ikke optimale til test af nye kemiske forbindelser til terapeutiske formål og lægemiddelopdagelser12.
Det skal bemærkes, at for at tilvejebringe en mere klinisk relevant murine model af venøs trombose med nedsat flow med endotelskade er der indført en venøs trombosemodel, hvor DVT udløses af begrænsningen af blodgennemstrømningen i fravær af endotelforstyrrelser. Modellen blev valideret ved scanning elektronmikroskopi15. En foretrukken klinisk relevant trombosemodel er en med næsten fuldstændig trombose, der muliggør lægemiddelopdagelser. Koagulationsdannelsen i de nuværende partielle okklusionsmodeller er inkonsekvent, hvilket resulterer i høj variation i koagulationsvægten og højderne12,16. Desuden er koagulationsvægten variabel med de konventionelle metoder, hvilket kræver flere mus pr. Undersøgelse12.
Tidligere kræftassocierede trombosemodeller fokuserede på tyktarms-, bugspytkirtel- og lungekræft og var alle komplette okklusionsmodeller17,18,19. Dette manuskript ændrer modellen for delvis okklusionstrombose for at give blodpropper lavere variabilitet og musedødelighed (figur 1). Tidligere undersøgelser brugte allogene kræftcellelinjer på immunkompromitterede athymiske mus baggrund 19,20,21. Dette manuskript bruger en MC-38 celle syngeneisk xenograft i C57Bl6/J mus, som tillader brug af immunkompetente mus og undersøgelse af immunkomponenter til trombogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
I en syngeneisk xenograft tyktarmskræftmodel observerer vi højere trombogenicitet og ekspressioner af koagulationsmarkører i forsøgsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Det er vigtigt, at variansen i alle disse parametre var lavere i den eksperimentelle gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. Modifikationen involverede introduktion af et vaskulært klip med en specifik trykprofil ved sammenløbspunktet for IVC og venstre nyrevene. Klippet blev placeret over en spacer, som var en 5-0 polypropylen sutur. Denne ænd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center grant 857078 (KR, VCC, XY og SL) og R01HL166608 (KR og VCC).
Materials
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
Riferimenti
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Ricerca sul cancro. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Ricerca sul cancro. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al. May-Thurner syndrome. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 11 (5), 1104-1111 (2021).
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
