癌のマウスモデルにおける静脈血栓症アッセイ
Summary
本稿では、マウスがんモデルにおける静脈血栓症を評価するための最適化された方法を提示し、血管クリップを使用して静脈結紮を実現します。最適化により、血栓症関連の測定値のばらつきが最小限に抑えられ、ヒトのがん関連静脈血栓症との関連性が高まります。
Abstract
この方法論の論文は、静脈血栓症のげっ歯類モデルの外科的ニュアンス、特に癌関連血栓症(CAT)の文脈で強調しています。深部静脈血栓症は、がん生存者によくみられる合併症であり、致命的となる可能性がある。現在のマウス静脈血栓症モデルでは、通常、縫合糸を使用した下大静脈(IVC)の完全または部分的な機械的閉塞が含まれます。この手順は、血液および内皮損傷の全体的または部分的なうっ滞を誘発し、血栓形成を引き起こします。現在のモデルには、血栓重量の変動性が高い、死亡率が有意である、学習曲線が長いなどの制限があります。このレポートでは、これらの制限のいくつかに対処するために、血管クリップを使用した外科的改良を紹介します。同系結腸癌異種移植マウスモデルを用いて、カスタマイズされた血管クリップを用いて、腎下大静脈を結紮しました。これらのクリップは、IVC結紮後の5-0ポリプロピレン縫合糸と同様の唇の残存スペースを可能にします。縫合法を用いたマウスを対照とした。血管クリップ法は、縫合法よりも変動の少ない、一貫した再現性のある部分血管閉塞とより大きな血栓重量をもたらしました。より大きな血栓重量、より大きな血栓量、およびIVC管腔表面積への血栓は、6-0ポリプロピレン縫合糸と比較して血管クリップの圧力プロファイルが高いため、予想されました。このアプローチはグレースケール超音波検査によって検証され、縫合法と比較して、血管クリップを使用した腎下大静脈の血栓量が一貫して大きいことが示されました。これらの観察結果は、免疫蛍光染色でさらに実証されました。本研究は、マウスの静脈血栓症モデルを作製する方法を改良したもので、CATのメカニズムの理解を深めるとともに、創薬などのトランスレーショナルリサーチに活用することができます。
Introduction
がん関連静脈血栓塞栓症(VTE)
静脈血栓塞栓症(VTE)のリスクは、一般集団と比較して、がん生存者では4〜7倍高い1,2,3。この状態は、がん患者の7人に1人で致命的であることが証明されています。VTEの発生率は、がんの種類や腫瘍量によって異なり、膵臓がんおよび胃がんの患者で最も高くなっています4。
がん患者におけるがん関連VTEは予後的に重要である。これは、年齢、人種、および基礎となるがんの病期を調整した後でも、がん診断後1年間の予後1年間の予後の全生存率の不良と関連している5。これらの知見は、がん関連VTEを調べることの重要性と、動物モデルを用いてそのメカニズムを調べる必要性を強調している。この領域のトランスレーショナルな関連性は、がん患者のVTEが血栓予防と抗血栓療法で予防および治療可能であるという事実によってさらに強調されています6。
がんと静脈血栓症の動物モデル
がんモデルは従来、異種移植片と呼ばれ、マウスにがん細胞を注入します。がん細胞をその起源のような部位に注入することは同所性モデルと呼ばれ、別の部位(脇腹の皮下面)への注入は異所性モデルとして知られています。がん細胞の起源種は、HT-29細胞株(ヒト結腸がん)などの同種モデルとして決定します7,8,9。それどころか、同系モデルでは、RenCa細胞株やMC-38細胞株などのマウスがん細胞株を使用します3,10。
文献には、げっ歯類の動脈血栓、静脈血栓症、毛細血管血栓症モデルが記載されています。静脈血栓症は、機械的損傷(ガイドワイヤー)または完全なIVC結紮、化学物質(塩化第二鉄)、または電解損傷によって下大静脈(IVC)に誘発されます。塩化第二鉄誘発性血栓症またはIVCライゲーションは、完全な閉塞モデルを表します。後者は、静脈に血液と炎症性浸潤のうっ滞をもたらします11,12,13。完全なライゲーションモデルでは、マウスの95%から100%で血栓症の形成率が高くなっています。部分的なIVC結紮モデルには、外側腸腰部枝の中断が含まれる場合があり、静脈還流は、IVC12の遠位標的点に縫合糸結紮を適用することによって廃止されます。時には、静脈還流を部分的に中断するためにスペースホルダーが使用されます。しかし、現在の部分閉塞モデルでは血栓重量に一貫性がなく、血栓重量と高さに大きなばらつきが生じている12,14。
これらの大きな静脈の力学モデル(部分的および完全)には制限があります。まず、IVC結紮(うっ滞モデル)はしばしば低血圧を引き起こします。血液は椎体静脈を通ってシャントされます。経験豊富な手ではありますが、このモデルの死亡率は5%〜30%の範囲であり、学習曲線中により高い率が予想されます。重要なことは、完全な閉塞モデルでは、血栓が通常非閉塞性であるヒトの深部静脈血栓症(DVT)を再現しないことです。完全な閉塞は、出血性因子と薬力学的パラメータを変化させ、局所部位の化合物のバイオアベイラビリティを変化させる可能性があります。これらの制限により、完全閉塞モデルは、治療目的や創薬のための新規化合物の試験には最適ではない可能性があります12。
内皮損傷を伴う血流の減少を伴う静脈血栓症のより臨床的に関連性のあるマウスモデルを提供するために、静脈血栓症モデルが導入されており、DVTは内皮破壊がない場合の血流の制限によって引き起こされることに注意する必要があります。このモデルは、走査型電子顕微鏡15によって検証された。好ましい臨床的に関連する血栓症モデルは、創薬を可能にするほぼ完全な血栓症のモデルです。現在の部分咬合モデルにおける血栓形成は一貫性がなく、その結果、血栓の重量と高さに大きなばらつきが生じます12,16。さらに、血栓重量は従来の方法で変動するため、研究ごとにより多くのマウスが必要になります12。
以前のがん関連血栓症モデルは、結腸がん、膵臓がん、および肺がんに焦点を当てており、すべて完全閉塞モデルでした17,18,19。この原稿では、部分咬合血栓モデルを修正して、変動性とマウス死亡率の低い血栓を提供します(図1)。以前の研究では、免疫不全の胸腺マウスのバックグラウンドで同種癌細胞株が使用されました19,20,21。この原稿では、C57Bl6/JマウスにMC-38細胞同系異種移植片を使用しており、免疫担当マウスを使用して、血栓形成に対する免疫成分を調べることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
同系異種移植大腸癌モデルでは、対照群と比較して、実験群でより高い血栓原性および凝固マーカーの発現が観察されます。重要なことは、これらすべてのパラメータの分散が、対照群と比較して実験群の方が低かったことです。この変更には、IVCと左腎静脈の合流点に特定の圧力プロファイルを持つ血管クリップを導入することが含まれていました。クリップは、5-0ポリプロピレン縫合糸?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center grant 857078 (KR、VCC、XY、SL) および R01HL166608 (KR および VCC) の支援を受けました。
Materials
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors – Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
Riferimenti
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Ricerca sul cancro. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Ricerca sul cancro. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al. May-Thurner syndrome. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 11 (5), 1104-1111 (2021).
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
