Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

Summary

Este artigo tem como objetivo apresentar um método otimizado para avaliação da trombose venosa em modelo de câncer em camundongos, utilizando clipes vasculares para a ligadura venosa. A otimização minimiza a variabilidade nas medidas relacionadas à trombose e aumenta a relevância para a trombose venosa associada ao câncer humano.

Abstract

Este artigo metodológico destaca as nuances cirúrgicas de um modelo de trombose venosa em roedores, especificamente no contexto da trombose associada ao câncer (TAC). A trombose venosa profunda é uma complicação comum em sobreviventes de câncer e pode ser potencialmente fatal. Os modelos atuais de trombose venosa murina tipicamente envolvem uma oclusão mecânica completa ou parcial da veia cava inferior (VCI) usando uma sutura. Esse procedimento induz estase total ou parcial de sangue e dano endotelial, desencadeando trombogênese. Os modelos atuais apresentam limitações, como maior variabilidade no peso dos coágulos, taxa de mortalidade significativa e curva de aprendizado prolongada. Este relato apresenta refinamentos cirúrgicos usando clipes vasculares para abordar algumas dessas limitações. Usando um modelo de xenoenxerto de câncer de cólon singênico em camundongos, empregamos clipes vasculares personalizados para ligar a veia cava infrarrenal. Esses clipes permitem espaço labial residual semelhante a uma sutura de polipropileno 5-0 após ligaduras da VCI. Camundongos com o método de sutura serviram como controles. O método do clipe vascular resultou em oclusão vascular parcial reprodutível consistente e maiores pesos de coágulos com menor variabilidade do que o método de sutura. Os maiores pesos do coágulo, maior massa do coágulo e área luminal do coágulo na VCI eram esperados devido ao maior perfil de pressão dos clipes vasculares em comparação com uma sutura de polipropileno 6-0. A abordagem foi validada pela ultrassonografia em escala de cinza, que revelou consistentemente maior massa de coágulos na veia cava infrarrenal com clipes vasculares em comparação com o método de sutura. Essas observações foram corroboradas com a coloração de imunofluorescência. Este estudo oferece um método aprimorado para gerar um modelo de trombose venosa em camundongos, que pode ser empregado para aprofundar a compreensão mecanicista da TAC e em pesquisas translacionais como a descoberta de drogas.

Introduction

Tromboembolismo venoso (TEV) associado ao câncer
O risco de tromboembolismo venoso (TEV) é 4 a 7 vezes maior em sobreviventes de câncer em comparação com a população geral ^1,2,3. Esta condição revela-se fatal em um em cada sete pacientes com câncer. A incidência de TEV varia dependendo do tipo de câncer e da carga tumoral e é maior entre pacientes com câncer de pâncreas e gástrico⁴.

O TEV associado ao câncer em pacientes com câncer tem significado prognóstico. Está associada à sobrevida global desfavorável no primeiro ano após o diagnóstico de câncer, mesmo após ajuste para idade, raça e estágio do câncer de base⁵. Esses achados destacam a importância de examinar o TEV associado ao câncer e a necessidade de investigar seu mecanismo usando um modelo animal. A relevância translacional dessa área é ainda mais enfatizada pelo fato de que o TEV em pacientes com câncer é evitável e tratável com tromboprofilaxia e terapia antitrombótica⁶.

Modelos animais de câncer e trombose venosa
Os modelos de câncer são convencionalmente denominados xenoenxertos, que envolvem a injeção de células cancerígenas em camundongos. A injeção de células cancerosas em um local como sua origem é referida como um modelo ortotópico, enquanto em um local diferente (plano subcutâneo sobre o flanco) é conhecida como um modelo heterotópico. A espécie de origem das células cancerosas as determina como um modelo alogênico, como a linhagem celular HT-29 (human colon cancer)^7,8,9. Ao contrário, os modelos singênicos utilizam as linhagens celulares de câncer murino, incluindo^{as linhagens} RenCa e MC-383,10.

A literatura tem descrito modelos de trombose arterial, venosa e capilar em roedores. A trombose venosa é induzida na veia cava inferior (VCI) por lesão mecânica (fio-guia) ou ligadura completa da VCI, química (cloreto férrico) ou lesão eletrolítica. A trombose induzida por cloreto férrico ou ligadura da VCI representa modelos de oclusão completa. Esta última resulta em estase de sangue e infiltrados inflamatórios nas veias^11,12,13. O modelo de ligadura completa resulta em uma alta taxa de formação de trombose em 95% a 100% dos camundongos. O modelo de ligadura parcial da VCI pode incluir a interrupção dos ramos iliolombares laterais, e o retorno venoso é revogado pela aplicação de ligaduras de sutura nos pontos-alvo distais da VCI¹². Às vezes, um suporte de espaço é usado para interromper parcialmente o retorno venoso. Entretanto, o peso do trombo é inconsistente no atual modelo de oclusão parcial, resultando em alta variabilidade no peso e altura do^{coágulo12,14}.

Ambos os modelos mecânicos de veias grandes (parciais e completas) apresentam limitações. Primeiro, a ligadura da VCI (modelo de estase) geralmente resulta em hipotensão. O sangue é desviado através das veias vertebrais. Embora em mãos experientes, a mortalidade com esse modelo varia de 5% a 30%, com a maior taxa esperada durante a curva de aprendizado. É importante ressaltar que o modelo de oclusão completa não reproduz trombose venosa profunda (TVP) em humanos, onde um trombo tipicamente é não-oclusivo. A oclusão completa pode alterar fatores hemorreológicos e parâmetros farmacodinâmicos, alterando a biodisponibilidade dos compostos no local. Devido a essas limitações, modelos de oclusão completa podem não ser ideais para testar novos compostos químicos para fins terapêuticos e descobertas de fármacos¹².

Deve-se notar que, para fornecer um modelo murino de trombose venosa mais relevante clinicamente com diminuição do fluxo com dano endotelial, um modelo de trombose venosa foi introduzido, onde a TVP é desencadeada pela restrição do fluxo sanguíneo na ausência de ruptura endotelial. O modelo foi validado por microscopia eletrônica de varredura¹⁵. Um modelo de trombose clinicamente relevante preferido é aquele com trombose quase completa que permite a descoberta de drogas. A formação de coágulos nos modelos atuais de oclusão parcial é inconsistente, resultando em alta variabilidade no peso e altura do coágulo^12,16. Além disso, o peso do coágulo é variável com os métodos convencionais, necessitando de mais camundongos por estudo¹².

Modelos prévios de trombose associada ao câncer focavam em câncer de cólon, pâncreas e pulmão e eram todos modelos de oclusão completa^17,18,19. Este manuscrito modifica o modelo de trombose oclusal parcial para proporcionar coágulos com menor variabilidade e mortalidade em camundongos (Figura 1). Estudos anteriores utilizaram linhagens de células cancerosas alogênicas em camundongos atímicos imunocomprometidos 19,20,21. Este manuscrito utiliza um xenoenxerto singênico de células MC-38 em camundongos C57Bl6/J, que permite o uso de camundongos imunocompetentes e o exame de componentes imunes à trombogênese.

Protocol

Para este estudo, foram utilizados 16 camundongos fêmeas C57Bl6/J, com 8-12 semanas de idade e peso corporal de 20 a 25 g. Os camundongos foram alojados em condições padrão e alimentados com ração e água ad libitum. Este estudo foi realizado com a aprovação do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Boston. Os procedimentos abertos aqui descritos foram realizados em condições estéreis. 1. Modelo de xenoenxerto Cultu…

Representative Results

Um grupo de camundongos fêmeas C57Bl6/J, com 8-12 semanas de idade, foi injetado com células MC-38 na fase logarítmica do crescimento celular. Os xenoenxertos cresceram rapidamente entre a terceira e a quarta semanas pós-injeção18. Uma vez que os tumores atingiram um volume médio de 400 mm3, os camundongos foram randomizados para os grupos controle e experimental. O grupo controle foi submetido à ligadura da VCI com sutura, enquanto os camundongos experimentais foram submetidos …

Discussion

Em um modelo singênico de câncer de cólon xenoenxerto, observamos maior trombogenicidade e expressão de marcadores de coagulação no grupo experimental em relação ao grupo controle. É importante ressaltar que a variância em todos esses parâmetros foi menor no grupo experimental em relação ao grupo controle. A modificação envolveu a introdução de um clipe vascular com perfil pressórico específico no ponto de confluência da VCI com a veia renal esquerda. O clipe foi colocado sobre um espaçador, que era …

Materials

Buprenorphine 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice	The Jackson Lab	IMSR_JAX:000664
Caliper	VWR International, Radnor, PA	12777-830
CD31	Abcam	Ab9498
Cell Counter	MOXIE	MXZ000
Clamp	Fine Science Tools	13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose,	Accurate Surgical & Scientific Instruments	PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps	Fine Science Tools	11252-00
Fibrin	Millipore	MABS2155-100UG
Fine Scissors – Large Loops	Fine Science Tools	14040-10
Forceps	Fine Science Tools	11002-12
Hill Hemostat	Fine Science Tools	13111-12
Isoflurane, USP	Covetrus	NDC 11695-6777-2
MC-38 cell	Sigma Aldrich	SCC172
Microscope	Nikon Eclipse Inverted Microscope	TE2000
Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Suture- Vicryl	AD-Surgical	#L-G330R24
Suture-Nylon 2-0	Ethilon	664H
Suture-Prolene 5-0	Ethicon	8661G
Suture-Prolene 6-0	Ethicon	PDP127
VEV03100	VisualSonics	FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix	The Well Bioscience	VHM01