Identifikation af peptider af små ekstracellulære vesikler fra knoglemarvafledte makrofager
Summary
Denne protokol beskriver en procedure til isolering af små ekstracellulære vesikler fra makrofager ved differentiel ultracentrifugering og ekstraktion af peptidomet til identifikation ved massespektrometri.
Abstract
Små ekstracellulære vesikler (sEV’er) udskilles typisk af exocytose af multivesikulære legemer (MVB’er). Disse nanovesikler med en diameter på <200 nm er til stede i forskellige kropsvæsker. Disse sEV'er regulerer forskellige biologiske processer såsom gentranskription og translation, celleproliferation og overlevelse, immunitet og betændelse gennem deres last, såsom proteiner, DNA, RNA og metabolitter. I øjeblikket er der udviklet forskellige teknikker til isolering af elbiler. Blandt dem betragtes den ultracentrifugeringsbaserede metode som guldstandarden og anvendes i vid udstrækning til isolering af sEV'er. Peptiderne er naturligt biomakromolekyler med mindre end 50 aminosyrer i længden. Disse peptider deltager i en række biologiske processer med biologisk aktivitet, såsom hormoner, neurotransmittere og cellevækstfaktorer. Peptidomet er beregnet til systematisk at analysere endogene peptider i specifikke biologiske prøver ved væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS). Her introducerede vi en protokol til isolering af sEV'er ved differentiel ultracentrifugering og ekstraheret peptidom til identifikation af LC-MS/MS. Denne metode identificerede hundredvis af sEVs-afledte peptider fra knoglemarvsafledte makrofager.
Introduction
Små ekstracellulære vesikler (sEV’er) med en diameter på mindre end 200 nm er til stede i næsten alle typer kropsvæsker og udskilles af alle slags celler, herunder urin, sved, tårer, cerebrospinalvæske og fostervand1. Oprindeligt blev sEV’er betragtet som beholdere til bortskaffelse af cellulært affald, hvilket førte til minimal forskning i det efterfølgende årti2. For nylig tyder stigende beviser på, at sEV’er indeholder specifikke proteiner, lipider, nukleinsyrer og andre metabolitter. Disse molekyler transporteres til målceller3, hvilket bidrager til intercellulær kommunikation, hvorigennem de deltager i forskellige biologiske processer, såsom vævsreparation, angiogenese, immunitet4 og betændelse5,6, tumorudvikling og metastase 7,8,9 osv.
For at lette undersøgelsen af sEV’er er det bydende nødvendigt at isolere sEV’er fra komplekse prøver. Forskellige sEVs isolationsmetoder er blevet udviklet baseret på de fysiske og kemiske egenskaber af sEV’er, såsom deres densitet, partikelstørrelse og overflademarkørproteiner. Disse teknikker omfatter ultracentrifugeringsbaserede metoder, partikelstørrelsesbaserede metoder, immunoaffinitetsfangstbaserede metoder, sEVs nedbørsbaserede metoder og mikrofluidikbaserede metoder10,11,12. Blandt disse teknikker er den ultracentrifugeringsbaserede metode bredt anerkendt som guldstandarden for isolering af sEV’er og er den mest almindeligt anvendte teknik13.
En stigende mængde beviser tyder på tilstedeværelsen af en lang række uopdagede biologisk aktive peptider i peptidomerne i forskellige organismer. Disse peptider bidrager væsentligt til adskillige fysiologiske processer ved at regulere vækst, udvikling, stressrespons 14,15 og signaltransduktion16. Formålet med sEVs peptidom er at afdække peptiderne, der bæres af disse sEV’er og give fingerpeg om deres biologiske funktioner. Her præsenterer vi en protokol til isolering af sEV’er gennem differentiel ultracentrifugering efterfulgt af ekstraktion af peptider fra disse sEV’er til yderligere analyse af deres peptidom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når man undersøger funktionen af sEV’er, er det bydende nødvendigt at opnå sEV’er med høj renhed fra komplekse biologiske prøver for at undgå potentielle kontamineringer. Der er udviklet en række forskellige metoder til isolering af sEV’er13, og blandt disse metoder har differentielle ultracentrifugeringsbaserede metoder vist relativt høj renhed af sEV’er. I denne undersøgelse blev 200 ml cellesupernatant opsamlet i 6 timer, og ca. 200-300 μg sEV blev opnået ved differentiel ultracentr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Natural Science Foundation of China (3157270). Vi takker Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, Kina) for at levere iBMDM.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
Riferimenti
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
