Questo protocollo descrive una procedura per isolare piccole vescicole extracellulari dai macrofagi mediante ultracentrifugazione differenziale ed estrarre il peptidoma per l'identificazione mediante spettrometria di massa.
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Articolo metodologico
Identificazione di peptidi di piccole vescicole extracellulari da macrofagi derivati dal midollo osseo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Piccole vescicole extracellulari (sEV) sono tipicamente secrete dall'esocitosi dei corpi multivescicolari (MVB). Queste nanovescicole con un diametro di <200 nm sono presenti in vari fluidi corporei. Queste sEV regolano vari processi biologici come la trascrizione e la traduzione genica, la proliferazione e la sopravvivenza cellulare, l'immunità e l'infiammazione attraverso i loro carichi, come proteine, DNA, RNA e metaboliti. Attualmente, sono state sviluppate varie tecniche per l'isolamento delle sEV. Tra questi, il metodo basato sull'ultracentrifugazione è considerato il gold standard ed è ampiamente utilizzato per l'isolamento delle sEV. I peptidi sono naturalmente biomacromolecole con meno di 50 amminoacidi di lunghezza. Questi peptidi partecipano a una varietà di processi biologici con attività biologica, come ormoni, neurotrasmettitori e fattori di crescita cellulare. Il peptidome ha lo scopo di analizzare sistematicamente peptidi endogeni in specifici campioni biologici mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS). Qui, abbiamo introdotto un protocollo per isolare le sEV mediante ultracentrifugazione differenziale e abbiamo estratto il peptidoma per l'identificazione mediante LC-MS/MS. Questo metodo ha identificato centinaia di peptidi derivati da sEVs da macrofagi derivati dal midollo osseo.
Introduzione
Piccole vescicole extracellulari (sEV) con un diametro inferiore a 200 nm sono presenti in quasi tutti i tipi di fluidi corporei e secrete da tutti i tipi di cellule, tra cui urina, sudore, lacrime, liquido cerebrospinale e liquido amniotico1. Inizialmente, le sEV erano considerate come contenitori per lo smaltimento dei rifiuti cellulari, il che ha portato a una ricerca minima nel decennio successivo2. Recentemente, prove crescenti indicano che le sEV contengono proteine, lipidi, acidi nucleici e altri metaboliti specifici. Queste molecole vengono trasportate alle cellule bersaglio3, contribuendo....
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Protocollo
1. Isolamento di piccole vescicole extracellulari
NOTA: Eseguire tutta la centrifugazione nei passaggi 1.1-1.11 a 4 °C.
- Preparazione di siero fetale bovino privo di sEV (FBS): centrifugare FBS per una notte a 110.000 × g a 4 °C attraverso un'ultracentrifuga (vedere la tabella dei materiali) per rimuovere le sEV endogene. Raccogliere il surnatante, sterilizzarlo con un filtro con una membrana di ultrafiltrazione da 0,2 μm e conservarlo a -20 °C.
- Placcare circa 3 x 107 macrofagi derivati dal midollo osseo immortalizzato (iBMDM) su una piastra di coltura da 150 mm e aggi....
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Risultati
Per le sEV isolate mediante ultracentrifugazione differenziale (Figura 1), ne abbiamo valutato la morfologia, la distribuzione granulometrica e i marcatori proteici secondo l'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV)17.
In primo luogo, la morfologia delle sEV è stata osservata mediante TEM, mostrando una tipica struttura a coppa (Figura 2A). L'NTA ha mostrato che le sEV isolate erano per lo più co.......
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Discussione
Quando si studia la funzione delle sEV, è imperativo ottenere sEV ad alta purezza da campioni biologici complessi per evitare potenziali contaminazioni. È stata sviluppata una varietà di metodi per l'isolamento delle sEV13 e, tra questi metodi, i metodi basati sull'ultracentrifugazione differenziale hanno mostrato una purezza relativamente elevata delle sEV. In questo studio, sono stati raccolti 200 mL di surnatante cellulare per 6 ore e circa 200-300 μg di sEV sono stati ottenuti mediante ultrace.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della Natural Science Foundation of China (3157270). Ringraziamo il Dr. Feng Shao (Istituto Nazionale di Scienze Biologiche, Cina) per aver fornito iBMDM.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit per il dosaggio delle proteine BCA | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Tubo filtrante centrifugo | Millipore | UFC5010BK | |
| Flaconi per centrifuga polipropilene | Beckman Coulter | 357003 | Substrato |
| chemiluminescente | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Ditiotreitolo | Solarbio | D8220 | 100 g |
| Terreno di coltura DMEM | Cell World | N? A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| Centrifuga ad alta velocità | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Rotore centrifugo (JA-25.50) |
| Macrofagi immortalizzati derivati dal midollo osseo (iBMDM) | Istituto nazionale di scienze biologiche, Cina | Fornito dal Dr. Feng Shao (Istituto nazionale di scienze biologiche, Cina) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Provetta Microfuge polipropilene | Beckman Coulter | 357448 | 1,5 mL, Ultracentrifuga da tavolo |
| sistema LC nano-ad alte prestazioni | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Analisi del tracciamento delle nanoparticelle | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Spettrometro di massa HF-X esattivo | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Solarbio | P1020 | |
| Provette per centrifuga in poliallomero | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuga |
| Inibitore della proteasi | Bimake | B14002 | |
| Concentratore a vuoto SpeedVac | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Ultracentrifuga da tavolo | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuga rotore (TLA 55) |
| Microscopio elettronico a trasmissione | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuga | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Rotore per ultracentrifuga (SW32 Ti) |
| Disgregatore cellulare ad ultrasuoni | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actina | Sigma | A3853 |
Riferimenti
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
- Mathieu, M., Marti....
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Ristampe e permessi
