Live-Cell Imaging av Drosophila melanogaster Tredje Instar Larval Brains
Summary
Her diskuterer vi en arbeidsflyt for å forberede, dissekere, montere og avbilde levende eksplante hjerner fra Drosophila melanogaster tredje instar larver for å observere cellulær og subcellulær dynamikk under fysiologiske forhold.
Abstract
Drosophila nevrale stamceller (neuroblaster, NBs heretter) gjennomgår asymmetriske divisjoner, regenererer den selvfornyende neuroblasten, samtidig som den danner en differensierende ganglionmodercelle (GMC), som vil gjennomgå en ekstra deling for å gi opphav til to nevroner eller glia. Studier i NBs har avdekket de molekylære mekanismene som ligger til grunn for cellepolaritet, spindelorientering, neural stamcelle selvfornyelse og differensiering. Disse asymmetriske celledelingene er lett observerbare via levende celleavbildning, noe som gjør larve NBs ideelt egnet for å undersøke den spatiotemporale dynamikken til asymmetrisk celledeling i levende vev. Når de dissekeres riktig og avbildes i næringstilskuddsmedium, deler NBs i eksplantehjerner seg robust i 12-20 timer. Tidligere beskrevne metoder er teknisk vanskelige og kan være utfordrende for de som er nye på feltet. Her beskrives en protokoll for fremstilling, disseksjon, montering og avbildning av levende tredjestjerners larvehjerneplanter ved bruk av fettkroppstilskudd. Potensielle problemer diskuteres også, og det gis eksempler på hvordan denne teknikken kan brukes.
Introduction
Asymmetrisk celledeling (ACD) er prosessen der subcellulære komponenter som RNA, proteiner og organeller fordeles ulikt mellom datterceller 1,2. Denne prosessen er ofte sett i stamceller, som gjennomgår ACD for å gi opphav til datterceller med forskjellige utviklingsskjebner. Drosophila NB deler seg asymmetrisk for å produsere en NB, som beholder sin stamme, og en ganglionmodercelle (GMC). GMC gjennomgår ytterligere divisjoner for å produsere differensierende nevroner eller glia3. Asymmetrisk delende NBs er rikelig i utviklingshjernen til tredje instar larver, som lett observeres via mikroskopi. På det tredje instar larvestadiet er det omtrent 100 NBs tilstede i hver sentral hjernelapp 3,4,5,6.
Asymmetrisk celledeling er en svært dynamisk prosess. Live-cell imaging protokoller har blitt brukt til å måle og kvantifisere dynamikken i cellepolaritet 7,8,9,10, spindelorientering 11,12,13, dynamikken i actomyosin cortex 14,15,16,17,18, mikrotubuli og sentrosombiologi 19,20,21,22,23,24,25,26,27, og membran 10,28 og kromatindynamikk 29. Kvalitative og kvantitative beskrivelser av ACD er avhengige av robuste metoder og protokoller for å avbilde NBs i intakte levende hjerner. Følgende protokoll skisserer metoder for å forberede, dissekere og avbilde tredje instar larvehjerner for live-celleavbildning in vivo ved hjelp av to forskjellige monteringsmetoder. Disse metodene er best egnet for forskere som er interessert i spatiotemporal dynamikk av stamcelledelinger, samt divisjoner i andre hjerneceller, da de tillater kort- og langsiktige observasjoner av cellulære hendelser. I tillegg er disse teknikkene lett tilgjengelige for nykommere til feltet. Vi demonstrerer effektiviteten og tilpasningsevnen til denne tilnærmingen med larvehjerner som uttrykker fluorescerende merkede mikrotubuli og kortikale fusjonsproteiner. I tillegg diskuterer vi analysemetoder og betraktninger for anvendelse i andre studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen skisserer en tilnærming for avbildning av levende eksplantehjerner fra Drosophila melanogaster larver. Protokollen beskrevet her gjør det mulig for eksplanthjerner å bli observert i 12-20 timer under de rette eksperimentelle forholdene. Det må tas særlig hensyn til utarbeidelse av prøver og utformingen av de ønskede forsøkene. Som nevnt ovenfor er en av de mest kritiske faktorene som bestemmer kvaliteten på det dissekerte vevet larvens helse. For å oppnå høyest mulig kvalitet må ma…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen støttes av R35GM148160 (C. C.) og en National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (RCS)
Materials
| 0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
| Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
| Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
| Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
| Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
| Confocal Microscope | Nikon | NA | |
| Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
| Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
| Dissection Microscope | Leica | NA | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
| Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
| Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
| Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
| Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
| Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
| Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
| Molasses | Genesee | 62-117 | |
| Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
| Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
| Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
| SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
| Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Riferimenti
- Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
- Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mechanisms of asymmetric cell division. Development. 147 (13), (2020).
- Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions. Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).
- Loyer, N., Januschke, J. Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts. Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).
- Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages. Seminars in Cell & Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).
- Oon, C. H., Prehoda, K. Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle. eLife. 8, e45815 (2019).
- Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).
- Oon, C. H., Prehoda, K. E. Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle. eLife. 10, e66574 (2021).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle. Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).
- Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Biologia dello sviluppo. 319 (1), 1-9 (2008).
- Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
- Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway. Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).
- Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts. Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).
- Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N. Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).
- Montembault, E., et al. Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage. Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).
- Roubinet, C., et al. Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells. Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).
- Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).
- Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).
- Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
- Lerit, D. A., et al. Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function. Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).
- Gallaud, E., et al. Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry. PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).
- Ramdas Nair, A., et al. The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).
- Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts. Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).
- LaFoya, B., Prehoda, K. E. Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells. Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).
- Sunchu, B., et al. Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo. Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).
- Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation. Biologia dello sviluppo. 475, 256-264 (2021).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).
- Lee, C. -. Y., et al. Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation. Genes & Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).
- Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages. PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules. Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).
- Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
