제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석
Summary
의약품(DP)에서 숙주 세포 단백질(HCP)을 농축하고 단백질체 농축 비드를 사용하여 펩타이드를 검출하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 자체 제조한 단클론 항체(mAb) 원료의약품(DS)을 사용하여 시연되며, 이는 성능 측면에서 다양한 방법을 평가하고 비교하기 위한 잘 특성화된 표준 물질입니다.
Abstract
숙주 세포 단백질(HCP)은 소량이라도 치료용 단백질에 악영향을 미칠 수 있는 불순물입니다. 의약품과 관련된 잠재적 위험을 평가하기 위해 저농도 HCP를 식별하는 방법이 개발되었습니다. 민감한 HCP 검출 방법을 개발하기 위한 중요한 접근법은 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 활용하여 분석 전에 단클론 항체(mAb)를 제거하는 동시에 HCP를 농축하는 것입니다.
이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질체 농축 비드를 사용하여 숙주 세포 단백질을 농축하기 위한 자세한 지침을 제공합니다. 이 비드에는 다양한 단백질에 대한 특정 친화력을 가진 다양한 헥사펩타이드 리간드 라이브러리가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 또한 나노 LC-MS/MS를 사용하여 제한된 분해 및 후속 펩타이드 검출을 통합합니다. 이러한 기술을 사용하면 존재비가 낮은 HCP를 7,000배 이상 농축할 수 있으며, 그 결과 0.002ppm의 놀라운 검출 한계를 달성할 수 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜을 통해 NIST mAb를 사용하여 높은 수준의 신뢰도로 850개의 HCP를 검출할 수 있다는 것입니다. 또한 사용자 친화적으로 설계되었으며 구현을 지원하는 비디오 데모가 포함되어 있습니다. 이러한 단계를 수행함으로써 연구자들은 HCP를 효과적으로 농축하고 검출하여 의약품에 대한 위험 평가의 민감도와 정확성을 향상시킬 수 있습니다.
Introduction
숙주 세포 단백질(HCP)은 숙주 유기체의 세포 배양에서 방출되고 단클론 항체(mAb)1,2,3,4와 함께 공동 정제되는 불순물입니다. HCP의 미량 수준은 의약품 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 ppm 미만에서 ppm 수준의 HCP를 검출하기 위해 민감한 HCP 분석 방법이 필요합니다.
직교 방법을 적용하여 HCP를 소량 검출할 수 있습니다. 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)은 일반적으로 전체 HCP를 정량화하는 데 사용되며, 해당 항체를 사용할 수 있는 경우 개별 HCP를 검출하고 정량화할 수도 있습니다16. 그러나 HCP 특이적 항체의 생산은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 대조적으로, 질량분석법(LC-MS)과 결합된 액체 크로마토그래피는 mAb 의약품의 개별 HCP에 대한 포괄적인 정보를 제공할 수 있으며 HCP 식별에 널리 적용됩니다 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27입니다.
LC-MS/MS를 가진 HCP를 검출하기 위해 제한된 분해20, 여과17, 단백질 A 결실21, 면역침전(IP) 및 ProteoMiner 농축(PM)18 등 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 대부분의 분석법은 LC-MS/MS 분석 전에 mAb의 양을 줄이고 HCP를 농축하여 mAb 펩타이드와 HCP 펩타이드 사이의 동적 범위를 줄이는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 ProteoMiner 기술과 제한된 분해(PMLD)를 결합한 단백질체 시료 농축 분석법을 제시합니다28. ProteoMiner 농축 원리는 다양한 조합 펩타이드 리간드 라이브러리를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 단백질체 농축 비드를 사용하는 것을 포함합니다. 이러한 리간드는 항체-의약품의 단백질에 특이적으로 결합하여 과잉 분자를 제거하는 동시에 저농도 숙주 세포 단백질(HCP)을 각각의 친화성 리간드에 집중시킵니다. 반면에, 제한된 소화의 원리는 낮은 농도의 트립신을 사용하는 것을 포함합니다. 이 농도는 소량의 HCP를 소화하기에는 충분하지만 모든 항체 의약품을 소화하기에는 충분하지 않습니다. 이 접근법은 용액에서 분해된 HCP 펩타이드의 회수 및 농축을 가능하게 합니다.
여과 방법과 비교하여, PMLD 기법은 검출된 HCP의 크기에 의해 제한되지 않는다17. 단백질 A 결실 방법은 항체와 관련된 HCP를 검출하는 데 특이적이며,21 면역침전은 항 HCP 항체가 생성된 특정 세포주(예: 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주)에서 사전 정의된 HCP로 제한됩니다4. 대조적으로, PMLD는 다양한 세포주의 의약품과 함께 정제된 모든 약물 모듈 및 숙주 세포 단백질에서 HCP를 검출하는 데 적용할 수 있습니다. 또한, PMLD는 언급된 방법(17,18,20,21,24)에 비해 더 나은 감도를 나타낸다.
이 접근법은 HCP 농도를 7000배까지 풍부하게 하고 검출 한계를 0.002ppm28로 낮출 수 있습니다. 실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시판되는 단백질 농축 비드에는 두 가지 버전이 있습니다: 하나는 더 작은 용량이고 다른 하나는 더 큰 용량입니다( 재료 표 참조). 두 가지 버전의 농축 비드에는 패키지에 10개의 프렙이 포함되어 있습니다. 제조업체의 지침에 따르면 소용량 키트의 각 준비는 총 단백질 10mg을 농축하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 DS에서 숙주 세포 단백질(HCP) 농축을 최적으로 수행하려면 각 분취?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
없음.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
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