Värdcellsproteinanalys med hjälp av berikningspärlor i kombination med begränsad matsmältning
Summary
Ett protokoll presenteras för att berika värdcellsproteiner (HCP) från läkemedelsprodukter (DP) och detektera peptider med hjälp av proteomanrikningspärlor. Metoden demonstreras med hjälp av en egentillverkad monoklonal antikropp (mAb) läkemedelssubstans (DS), som är ett välkarakteriserat referensmaterial för att utvärdera och jämföra olika metoder med avseende på prestanda.
Abstract
Värdcellsproteiner (HCP) är föroreningar som kan påverka terapeutiska proteiner negativt, även i små mängder. För att utvärdera de potentiella riskerna i samband med läkemedelsprodukter har metoder utvecklats för att identifiera hälso- och sjukvårdspersonal med låg förekomst. Ett viktigt tillvägagångssätt för att utveckla en känslig HCP-detektionsmetod är att berika HCP:er och samtidigt avlägsna monoklonala antikroppar (mAbs) före analys, med hjälp av vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS).
Detta protokoll erbjuder detaljerade instruktioner för anrikning av värdcellsproteiner med hjälp av kommersiellt tillgängliga proteomanrikningspärlor. Dessa pärlor innehåller ett varierat bibliotek av hexapeptidligander med specifika affiniteter för olika proteiner. Protokollet innehåller också begränsad matsmältning och efterföljande peptiddetektion med hjälp av nano LC-MS/MS. Genom att använda dessa tekniker kan HCP:er med låg förekomst anrikas över 7000 gånger, vilket resulterar i en imponerande detektionsgräns så låg som 0,002 ppm. Betecknande nog möjliggör detta protokoll detektering av 850 hälso- och sjukvårdspersonal med en hög konfidensnivå med hjälp av en NIST-mAb. Dessutom är den utformad för att vara användarvänlig och innehåller en videodemonstration för att hjälpa till med implementeringen. Genom att följa dessa steg kan forskare effektivt berika och upptäcka hälso- och sjukvårdspersonal, vilket ökar känsligheten och noggrannheten i riskbedömningen av läkemedelsprodukter.
Introduction
Värdcellsproteiner (HCP) är föroreningar som frigörs från värdorganismens cellkultur och samrenas med monoklonala antikroppar (mAb)1,2,3,4. Spårnivåer av hälso- och sjukvårdspersonal kan ha en negativ inverkan på kvaliteten på läkemedlet 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, och därför är en känslig HCP-analysmetod önskvärd för att detektera HCP:er i sub-ppm- till ppm-nivåer.
Ortogonala metoder kan användas för att detektera hälso- och sjukvårdspersonal i låg förekomst. Enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) används i allmänhet för att kvantifiera den totala hälso- och sjukvårdspersonalen, och den kan också detektera och kvantifiera enskilda hälso- och sjukvårdspersonal om motsvarande antikroppar finns tillgängliga16. Produktionen av HCP-specifika antikroppar är dock tidskrävande och arbetskrävande. Däremot kan vätskekromatografi i kombination med masspektrometri (LC-MS) ge omfattande information om enskilda hälso- och sjukvårdspersonal i mAb-läkemedelsprodukter och används i stor utsträckning för HCP-identifiering 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Flera metoder har utvecklats för att detektera hälso- och sjukvårdspersonal med LC-MS/MS, inklusive begränsad nedbrytning20, filtrering17, protein A-deletion21, immunoprecipitering (IP) och ProteoMiner-anrikning (PM)18. De flesta metoder syftar till att minska mängden mAb och berika hälso- och sjukvårdspersonal före LC-MS/MS-analys, och därigenom minska det dynamiska intervallet mellan mAb-peptider och HCP-peptider. Detta protokoll presenterar en proteomisk provanrikningsmetod som kombinerar ProteoMiner-teknik och begränsad nedbrytning (PMLD)28. ProteoMiner-anrikningsprincipen innebär att man använder kommersiellt tillgängliga proteomanrikningspärlor som innehåller ett varierat bibliotek av kombinatoriska peptidligander. Dessa ligander binder specifikt till proteiner på antikroppsprodukter, vilket gör det möjligt att avlägsna överflödiga molekyler samtidigt som värdcellsproteiner (HCP) med låg förekomst koncentreras på deras respektive affinitetsligander. Å andra sidan innebär principen om begränsad matsmältning att man använder en låg koncentration av trypsin. Denna koncentration är tillräcklig för att smälta hälso- och sjukvårdspersonal med låg förekomst, men inte tillräcklig för att smälta alla antikroppsläkemedel. Detta tillvägagångssätt möjliggör återvinning och anrikning av smälta HCP-peptider från lösningen.
Jämfört med filtreringsmetoder är PMLD-tekniken inte begränsad av storleken på de detekterade hälso- och sjukvårdspersonalen17. Deletionsmetoder för protein A är specifika för att detektera HCP associerade med antikroppar21, medan immunprecipitering är begränsad till fördefinierade HCP:er från en viss cellinje (t.ex. cellinjen Chinese Hamster Ovary (CHO), där en anti-HCP-antikropp genererades4. Däremot kan PMLD användas för att detektera HCP:er från alla läkemedelsmoduler och värdcellsproteiner som samrenats med läkemedelsprodukter från olika cellinjer. Dessutom uppvisar PMLD bättre känslighet jämfört med de nämnda metoderna 17,18,20,21,24.
Detta tillvägagångssätt kan berika HCP-koncentrationen med 7000 gånger och sänka detektionsgränsen till 0,002 ppm28. Den experimentella uppställningen illustreras i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns två versioner av kommersiellt tillgängliga proteinberikande pärlor: en med mindre kapacitet och den andra med större kapacitet (se materialtabell). Båda versionerna av berikningspärlorna innehåller tio förberedelser i förpackningen. Tillverkarens instruktioner föreslår att varje förberedelse från det lilla kapacitetspaketet kan användas för att berika 10 mg totalt protein. Men för optimal prestanda för anrikning av värdcellsprotein (HCP) från DS är varje förberedelse bra f?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
Riferimenti
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
