Viene presentato un protocollo per l'arricchimento delle proteine della cellula ospite (HCP) da prodotti farmaceutici (DP) e la rilevazione di peptidi utilizzando perle di arricchimento del proteoma. Il metodo è dimostrato utilizzando una sostanza farmaceutica (DS) a base di anticorpi monoclonali (mAb) prodotta internamente, che è un materiale di riferimento ben caratterizzato per la valutazione e il confronto di diversi metodi in termini di prestazioni.
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Articolo metodologico
Analisi delle proteine delle cellule ospiti utilizzando perle di arricchimento accoppiate a digestione limitata
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che possono influire negativamente sulle proteine terapeutiche, anche in piccole quantità. Per valutare i potenziali rischi associati ai prodotti farmaceutici, sono stati sviluppati metodi per identificare gli operatori sanitari a bassa abbondanza. Un approccio cruciale per lo sviluppo di un metodo di rilevamento sensibile degli HCP prevede l'arricchimento degli HCP e la contemporanea rimozione degli anticorpi monoclonali (mAb) prima dell'analisi, utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS).
Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per l'arricchimento delle proteine della cellula ospite utilizzando perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio. Queste perle contengono una libreria diversificata di ligandi esapeptidici con affinità specifiche per diverse proteine. Il protocollo incorpora anche una digestione limitata e il successivo rilevamento dei peptidi utilizzando nano LC-MS/MS. Impiegando queste tecniche, gli HCP con bassa abbondanza possono essere arricchiti di oltre 7000 volte, con un limite di rilevamento impressionante fino a 0,002 ppm. Significativamente, questo protocollo consente il rilevamento di 850 HCP con un alto livello di confidenza utilizzando un anticorpo monoclonale NIST. Inoltre, è progettato per essere facile da usare e include una dimostrazione video per assisterne l'implementazione. Seguendo questi passaggi, i ricercatori possono arricchire e rilevare efficacemente gli operatori sanitari, migliorando la sensibilità e l'accuratezza della valutazione del rischio per i prodotti farmaceutici.
Introduzione
Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che vengono rilasciate dalla coltura cellulare dell'organismo ospite e co-purificate con l'anticorpo monoclonale (mAb)1,2,3,4. I livelli di tracce di HCP possono avere un impatto negativo sulla qualità del prodotto farmaceutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, pertanto....
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Protocollo
Le abbreviazioni utilizzate nel protocollo sono elencate nella tabella supplementare 1.
1. Preparazione di soluzioni e tamponi
NOTA: I dettagli commerciali di tutti i reagenti sono elencati nella Tabella dei materiali.
- Preparare una soluzione 0,1 M di Tris-HCl, pH 8,0 aggiungendo 1 mL di 1 M Tris-HCl, pH 8,0 in 9 mL di acqua deionizzata in un flaconcino di vetro e mescolare bene mediante vortex. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
- Preparare 24 mM di desossicolato di sodio (SDC) sciogliendo 10 mg di SDC in 1 mL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0....
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Risultati
Questo protocollo ha presentato un flusso di lavoro per la preparazione del campione, denominato arricchimento proteico accoppiato con digestione limitata (PMLD), per l'analisi delle proteine della cellula ospite (HCP) in un campione di anticorpi monoclonali (mAb). La Figura 1 illustra la procedura passo-passo di PMLD. I ricercatori hanno confrontato i risultati dell'analisi HCP utilizzando la digestione diretta (mostrata nel pannello superiore della Figura 2) e PMLD (mostrata nel pannello i.......
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Discussione
Esistono due versioni di perle di arricchimento proteico disponibili in commercio: una con una capacità inferiore e l'altra con una capacità maggiore (vedi Tabella dei materiali). Entrambe le versioni delle perle di arricchimento contengono dieci preparazioni nella confezione. Le istruzioni del produttore suggeriscono che ogni preparazione del kit di piccola capacità può essere utilizzata per arricchire 10 mg di proteine totali. Tuttavia, per prestazioni ottimali dell'arricchimento di proteine della cell.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 16 G, ago con mozzo in metallo, 2 pollici, stile a punta 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 colonna trappola (20 cm e tempi; 0,075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| acetonitrile con acido formico allo 0,1% (v/v), grado Optima LC/MS | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-0.5 | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 (0,075 mm & 1,7 &m; m &volte; 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuga 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Fritta per cartucce SPE, 9,5 mm, 3 mL, 100/pz | Agilent | 12131020 | |
| Punta GL GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| mAb interno | Concentrazione Regeneron | 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9,3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanolo | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Istidina | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Istidina monocloridrato monoidrato | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Metanolo | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0,5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2,0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Bio-Rad | ||
| 1633007 | |||
| ProteoMiner Kit di Arricchimento Proteico di Piccola Capacità | Bio-Rad | 1633006 | |
| Desossicolato di sodio (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodio lauroil sarcosinato (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Acido trifluoracetico (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Tripsina (grado di sequenziamento modificato) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tubo Revolver Rotatore | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Acqua con 0.1% di acido formico (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
Riferimenti
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C.
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Ristampe e permessi
