Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau
Summary
Es wird ein Protokoll zur Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCPs) aus Arzneimitteln (DP) und zum Nachweis von Peptiden mit Hilfe von Proteom-Anreicherungskügelchen vorgestellt. Die Methode wird anhand eines selbst hergestellten monoklonalen Antikörpers (mAb) Drug Substance (DS) demonstriert, der ein gut charakterisiertes Referenzmaterial für die Bewertung und den Vergleich verschiedener Methoden in Bezug auf die Leistung darstellt.
Abstract
Wirtszellproteine (HCPs) sind Verunreinigungen, die sich bereits in geringen Mengen negativ auf therapeutische Proteine auswirken können. Um die potenziellen Risiken im Zusammenhang mit Arzneimitteln zu bewerten, wurden Methoden entwickelt, um HCPs mit geringer Häufigkeit zu identifizieren. Ein entscheidender Ansatz für die Entwicklung einer sensitiven HCP-Nachweismethode besteht darin, HCPs anzureichern und gleichzeitig monoklonale Antikörper (mAbs) vor der Analyse mit Hilfe der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) zu entfernen.
Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Anreicherung von Wirtszellproteinen mit kommerziell erhältlichen Proteom-Anreicherungskügelchen. Diese Kügelchen enthalten eine vielfältige Bibliothek von Hexapeptid-Liganden mit spezifischen Affinitäten für verschiedene Proteine. Das Protokoll umfasst auch einen begrenzten Aufschluss und die anschließende Peptiddetektion mittels Nano-LC-MS/MS. Durch den Einsatz dieser Techniken können HCPs mit geringer Häufigkeit über 7000-fach angereichert werden, was zu einer beeindruckenden Nachweisgrenze von nur 0,002 ppm führt. Bezeichnenderweise ermöglicht dieses Protokoll die Erkennung von 850 HCPs mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit unter Verwendung eines NIST-mAbs. Darüber hinaus ist es benutzerfreundlich gestaltet und enthält eine Videodemonstration, die bei der Implementierung hilft. Durch die Befolgung dieser Schritte können Forscher HCPs effektiv anreichern und nachweisen und so die Sensitivität und Genauigkeit der Risikobewertung für Arzneimittel verbessern.
Introduction
Wirtszellproteine (HCPs) sind Verunreinigungen, die aus der Zellkultur des Wirtsorganismus freigesetzt und mit monoklonalen Antikörpern (mAb) gereinigt werden1,2,3,4. Spurenkonzentrationen von HCPs können sich negativ auf die Qualität des Arzneimittelsauswirken 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, und daher ist eine empfindliche HCP-Analysemethode erforderlich, um HCPs in Sub-ppm- bis ppm-Konzentrationen nachzuweisen.
Orthogonale Methoden können angewendet werden, um HCPs in geringer Häufigkeit zu detektieren. Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird im Allgemeinen zur Quantifizierung der gesamten HCPs verwendet und kann auch einzelne HCPs nachweisen und quantifizieren, wenn die entsprechenden Antikörper verfügbar sind16. Die Herstellung von HCP-spezifischen Antikörpern ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv. Im Gegensatz dazu kann die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (LC-MS) umfassende Informationen über einzelne HCPs in mAb-Arzneimitteln liefern und wird häufig für die HCP-Identifizierung eingesetzt 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um HCPs mit LC-MS/MS nachzuweisen, darunter begrenzter Aufschluss20, Filtration17, Protein-A-Deletion21, Immunpräzipitation (IP) und ProteoMiner-Anreicherung (PM)18. Die meisten Methoden zielen darauf ab, die Menge an mAb zu reduzieren und HCPs vor der LC-MS/MS-Analyse anzureichern, wodurch der dynamische Bereich zwischen mAb-Peptiden und HCP-Peptiden verringert wird. Dieses Protokoll stellt eine proteomische Probenanreicherungsmethode vor, die die ProteoMiner-Technologie und den begrenzten Aufschluss (PMLD) kombiniert28. Das Prinzip der ProteoMiner-Anreicherung beinhaltet die Verwendung kommerziell erhältlicher Proteom-Anreicherungskügelchen, die eine vielfältige Bibliothek kombinatorischer Peptidliganden enthalten. Diese Liganden binden spezifisch an Proteine auf Antikörper-Wirkstoff-Produkten und ermöglichen so die Entfernung überschüssiger Moleküle, während Wirtszellproteine (HCPs) mit geringer Häufigkeit auf ihre jeweiligen Affinitätsliganden konzentriert werden. Auf der anderen Seite beinhaltet das Prinzip der begrenzten Verdauung die Verwendung einer niedrigen Konzentration von Trypsin. Diese Konzentration reicht aus, um HCPs mit geringer Häufigkeit zu verdauen, aber nicht genug, um alle Antikörper-Wirkstoffprodukte zu verdauen. Dieser Ansatz ermöglicht die Rückgewinnung und Anreicherung von verdauten HCP-Peptiden aus der Lösung.
Im Vergleich zu Filtrationsverfahren ist die PMLD-Technik nicht durch die Größe der detektierten HCPs17 begrenzt. Protein-A-Deletionsmethoden sind spezifisch für den Nachweis von HCPs, die mit Antikörpern assoziiert sind21, während die Immunpräzipitation auf vordefinierte HCPs aus einer bestimmten Zelllinie (z. B. der Zelllinie des chinesischen Hamster-Eierstocks (CHO)) beschränkt ist, bei der ein Anti-HCP-Antikörper erzeugt wurde4. Im Gegensatz dazu kann PMLD zum Nachweis von HCPs aus beliebigen Wirkstoffmodulen und Wirtszellproteinen eingesetzt werden, die mit Arzneimitteln aus verschiedenen Zelllinien gereinigt wurden. Darüber hinaus weist PMLD eine bessere Sensitivität im Vergleich zu den genannten Methoden auf 17,18,20,21,24.
Dieser Ansatz kann die HCP-Konzentration um das 7000-fache anreichern und die Nachweisgrenze auf 0,002 ppm senken28. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei Versionen von kommerziell erhältlichen Proteinanreicherungskügelchen: eine mit kleinerer Kapazität und die andere mit größerer Kapazität (siehe Materialtabelle). Beide Versionen der Anreicherungsperlen enthalten zehn Preps in der Packung. Die Anweisungen des Herstellers deuten darauf hin, dass jedes Präparat aus dem Kit mit geringer Kapazität verwendet werden kann, um 10 mg Gesamtprotein anzureichern. Für eine optimale Leistung der Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCP) durch DS …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
Riferimenti
- Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
- Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
- Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
- Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
- Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
- Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
- Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
- Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
- Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
- Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
- Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
- Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
- Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
- Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
- Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
- Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
- Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
- Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
- Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
- Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
- Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
- Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
- Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
- Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
- Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
- Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
- Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
- Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
- Uniprot1. . , (2023).
- Uniprot2. . , (2023).
