인간 골육종 세포에서 긴 비코딩 RNA 국소화를 위한 RNA Fluorescence In Situ Hybridization
Summary
본 프로토콜은 인간 골육종 세포에서 lncRNA를 국소화하기 위한 RNA 형광 in situ 교잡의 방법을 기술한다.
Abstract
암세포의 증식, 상피-중간엽 전이(EMT), 이동, 침투 및 자가포식을 조절하는 것과 같은 암에서 긴 비암호화 RNA(lncRNA)의 중요한 역할이 연구되었습니다. 세포에서 lncRNA의 국소화 검출은 세포의 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 형광 염료로 표지한 후 lncRNA 특이적 안티센스 사슬 서열을 설계함으로써 RNA 형광 in situ hybridization(FISH)을 적용하여 lncRNA의 세포 국소화를 검출할 수 있습니다. 현미경 검사법의 발달과 함께, RNA 물고기 기술은 지금 잘 표현되지 않는 lncRNAs의 구상 조차 허용합니다. 이 방법은 lncRNA의 국소화를 단독으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라 이중색 또는 다색 면역형광을 사용하여 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화도 검출할 수 있습니다. 여기에서는 인간 골육종 세포(143B)에서 lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6)을 예로 들어 RNA FISH의 상세한 실험 조작 절차 및 주의사항을 포함하여, RNA FISH 실험, 특히 lncRNA FISH를 수행하고자 하는 연구자들에게 참고자료를 제공하였다.
Introduction
인간 게놈에 대한 우리의 이해는 최근 전체 게놈 기술의 발전으로 크게 확장되었습니다. 인간 게놈의 약 93%는 RNA로 전사될 수 있지만 RNA의 2%만 단백질로 번역될 수 있습니다. 단백질 번역 기능이 없는 나머지 98%의 RNA를 non-coding RNA(ncRNA)라고 합니다1. 200개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 긴 ncRNA(noncoding RNA(ncRNA)의 한 종류인 긴 ncRNA(lncRNA)는 분화, 주기 조절, 세포자멸사, 이동 및 침습과 같은 세포의 많은 생리학적 및 병리학적 과정에 관여하기 때문에 점점 더 주목을 받고 있습니다 3,4,5. LncRNA는 염색질 구조 및 핵 유전자 발현 조절, mRNA 접합 과정 제어, 전사 후 변형 등 다양한 메커니즘을 통해 역할을 수행합니다6. LncRNA는 전사 및 전사 후 수준 모두에서 악성 종양의 발생, 발달 및 전이를 조절합니다. 전사 조절은 염색체 구조에 대한 결합을 통해 RNA 전사에 영향을 미침으로써 핵에서 실현되는 반면, 전사 후 조절은 내인성 경쟁 RNA(ceRNA) 메커니즘을 통해 표적 유전자를 제어하여 세포질에서 실현됩니다 5,7,8. CeRNA는 RNA 상호 작용의 새로운 메커니즘, 즉 lncRNA가 miRNA를 흡착하고 관련 표적 유전자의 miRNA 매개 분해를 억제하는 스폰지 역할을 할 수 있음을 밝혔습니다9. 그러므로, lncRNAs의 subcellular 국소화에 관하여 정보는, 특정한 lncRNA가 세포질 또는 핵에서 있다는 것을, 그들의 생물학 기능을 확인하는 것을 돕도록 중요합니다.
현재 lncRNA 국소화는 주로 두 가지 방법으로 검출되는데, 하나는 핵/세포질 분획 분리 분석에 의한 것이고 다른 하나는 RNA FISH에 의한 것입니다. 전자에서는 세포질 및 핵 분획의 RNA를 각각 추출한 다음 특정 lncRNA 프라이머로 PCR 증폭을 수행하여 세포질과 핵에서 lncRNA의 비율을 검출합니다. 이 방법의 장점은 시간 효율성인 반면, 단점은 실제 lncRNA 국소화가 세포질과 핵에서 lncRNA의 상대적 비율에 의해 직접 반영되지 않는다는 것입니다. RNA FISH는 형광 염료10으로 표지한 후 lncRNA 특이적 안티센스 사슬 서열의 설계를 통해 세포에서 lncRNA 국소화를 검출할 수 있습니다. RNA FISH 분석법은 형광단 표지된 다중 올리고 프로브 세트(11), LNA 프로브(12) 및 분지형 DNA(bDNA) 프로브(13)를 포함한 프로브 기술 및 검출 방법의 발전으로 개선되었습니다. RNA FISH는 lncRNA의 국소화를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 이중색 또는 다색 면역형광을 사용하여 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화도 검출할 수 있습니다14.
이 연구에서는 RNA FISH에 의한 골육종 세포(143B)에서 lncRNA small nucleolar RNA host gene 6(SNHG6)의 상세한 세포 내 국소화 검출 프로토콜을 예로 포함했습니다. SNHG6는 성숙한 접합 형태의 600-730 뉴클레오티드 lncRNA이며 대장암, 위암, 난소 투명 세포 암종, 골육종 및 간세포 암종을 포함한 다양한 인간 암에서 새로운 종양 유전자로 확인되었습니다15,16,17,18. 연구에 따르면 SNHG6는 증식, EMT 및 자가포식과 같은 암세포의 생물학적 행동에 관여하는 것으로 확인되었으며, miRNA15,16,17에 결합(스폰지)하여 표적 유전자에 영향을 미칠 수 있는 SNHG6의 세포질 국소화를 보여주었습니다. RNA FISH에 의한 SNHG6 세포내 국소화의 상세한 검출 프로토콜이 본원에 제시되어 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 RNA FISH 프로토콜은 세포에서 lncRNA의 국소화를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 세포에서 다른 RNA, DNA 또는 단백질의 공동 국소화를 검출할 수 있으며, 이는 파라핀 포매 조직에서 lncRNA의 위치를 검출하는 데에도 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 경우에서의 구체적인 프로토콜은 상이한데, 그 이유는 파라핀-포매 조직이 탈왁스될 필요가 있기 때문이다21. 이 실험 절차는 48웰 또…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 (1) 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2020YFE0201600)의 보조금으로 지원됩니다. (2) 국립자연과학재단(National Nature Science Foundation, 81973877 및 82174408) (3) 병원 TCM 준비의 산업 전환의 상하이 협력 혁신 센터; (4) Shanghai University of Traditional Chinese Medicine 예산 내 연구 프로젝트(2021LK047).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
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