تعديل في الجسم الحي مصفوفة هلام المكونات مقايسة لدراسات تولد الأوعية
Summary
يمكن للطريقة المعروضة هنا تقييم تأثير الكواشف على تكوين الأوعية الدموية أو نفاذية الأوعية الدموية في الجسم الحي دون تلطيخ. تستخدم الطريقة حقن ديكستران-FITC عبر الوريد الخلفي لتصور الأوعية الجديدة أو تسرب الأوعية الدموية.
Abstract
تم تطوير العديد من النماذج للتحقيق في تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي. ومع ذلك ، فإن معظم هذه النماذج معقدة ومكلفة ، وتتطلب معدات متخصصة ، أو يصعب تنفيذها للتحليل الكمي اللاحق. نقدم هنا مقايسة سدادة هلام مصفوفة معدلة لتقييم تكوين الأوعية في الجسم الحي. في هذا البروتوكول ، تم خلط الخلايا الوعائية مع هلام المصفوفة في وجود أو عدم وجود كواشف مؤيدة لتولد الأوعية أو مضادة لتولد الأوعية ، ثم حقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران المتلقية. بعد 7 أيام ، يتم حقن محلول ملحي عازل للفوسفات يحتوي على ديكستران-FITC عبر الوريد الذيلي ويتم تدويره في أوعية لمدة 30 دقيقة. يتم جمع سدادات هلام المصفوفة ودمجها مع هلام تضمين الأنسجة ، ثم يتم قطع أقسام 12 ميكرومتر للكشف عن التألق دون تلطيخ. في هذا الفحص ، يمكن استخدام dextran-FITC ذو الوزن الجزيئي العالي (~ 150000 Da) للإشارة إلى الأوعية الوظيفية للكشف عن طولها ، بينما يمكن استخدام dextran-FITC ذات الوزن الجزيئي المنخفض (~ 4400 Da) للإشارة إلى نفاذية الأوعية الجديدة. في الختام ، يمكن أن يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة ومريحة للدراسة الكمية لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي.
Introduction
يلعب تكوين الأوعية ، عملية تكوين الأوعية الجديدة من الأوعية الموجودة مسبقا ، دورا مهما في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ، مثل التطور الجنيني ، والتئام الجروح ، وتصلب الشرايين ، وتطور الورم ، وما إلى ذلك 1،2،3،4،5. تتضمن هذه العملية الديناميكية عدة خطوات ، بما في ذلك تدهور المصفوفة ، وتكاثر الخلايا الوعائية ، والهجرة والتنظيم الذاتي لتشكيل هياكل أنبوبية وتثبيت الأوعية الجديدة6. ثبت أن تعزيز تكوين الأوعية أمر بالغ الأهمية في علاج احتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية وأنواع أخرى من الأمراض الإقفارية7 بينما يعتبر تثبيط تكوين الأوعية استراتيجية واعدة في علاج السرطانات8 وأمراض الروماتويد9. يعتبر تكوين الأوعية مبدأ تنظيميا لاكتشاف الأدوية10. وبالتالي ، فإن بناء طريقة موثوقة ومريحة لتقييم مدى تكوين الأوعية أمر بالغ الأهمية للبحث الميكانيكي أو اكتشاف الأدوية في الأمراض التي تعتمد على تولد الأوعية.
تم تطوير العديد من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي لتقييم تولد الأوعية11. من بين هذه النماذج ، لا يمكن للنماذج ثنائية الأبعاد (2-D) ، مثل فحص تشكيل أنبوب هلامالمصفوفة 12 ، تشكيل هياكل أنبوبية وظيفية. يمكن للنماذج الحيوانية ، مثل نموذج نقص تروية الطرف الخلفي13،14 ، إعادة إنتاج عملية تكوين الأوعية ولكنها معقدة وتتطلب نظام تصوير تدفق الدم بالليزر البقعي. توفر النماذج ثلاثية الأبعاد لتشكل الأوعية الدموية ، مثل مقايسة سدادة هلام المصفوفة ، منصة بسيطة يمكنها تقليد عملية تكوين الأوعية في الجسم الحي15 ، لكن اكتشاف تكوين الأوعية يتطلب الكيمياء المناعية أو تلطيخ التألق المناعي16،17،18 ، وهي متغيرة وسيئة التصور.
هنا ، نصف بروتوكولا لمقايسة سدادة هلام المصفوفة المعدلة حيث تم خلط خلايا الأوعية الدموية مع هلام المصفوفة وحقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران لتشكيل سدادة. في السدادة ، تحتاج الخلايا الوعائية إلى تحلل المصفوفة ، والتكاثر ، والهجرة ، والتنظيم الذاتي لتشكيل أوعية وظيفية في النهاية مع تدفق الدم في البيئة الداخلية. بعد ذلك ، يتم حقن ديكستران المسمى بالفلورسنت عبر الوريد الخلفي ، ليتدفق عبر القابس ، ويتم تصور الملصق للإشارة إلى الأوعية الجديدة. يمكن تقييم محتوى تولد الأوعية كميا من خلال طول الأوعية. يمكن أن تشكل هذه الطريقة أوعية وظيفية لا يمكن إنتاجها في نماذج تولد الأوعية ثنائية الأبعاد12 ، ولا تحتاج إلى عملية صبغ معقدة كما هو الحال في مقايسة سدادة هلام المصفوفةالعادية 11. كما أنه لا يتطلب أدوات محددة باهظة الثمن مثل نظام تصوير تدفق الدم بالليزر في نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية13،14،19. هذه الطريقة متعددة الاستخدامات ومنخفضة التكلفة وقابلة للقياس الكمي وسهلة الأداء ، ويمكن استخدامها لتحديد القدرة المؤيدة أو المضادة لتولد الأوعية الدموية للأدوية أو استخدامها في الأبحاث الميكانيكية المشاركة في تكوين الأوعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم طريقة موثوقة ومريحة للتقييم الكمي لتكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي دون تلطيخ. في هذا البروتوكول ، تم خلط الخلايا الوعائية مع هلام المصفوفة في وجود كواشف مؤيدة لتولد الأوعية أو مضادة لتولد الأوعية ، ثم حقنها تحت الجلد في الجزء الخلفي من الفئران Nu / Nu لتشكيل سدادة هلامية (<strong cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة تشجيانغ (LY22H020005) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81873466).
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion – Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
