Modificeret In vivo Matrix Gel Plug Assay til angiogenese undersøgelser
Summary
Metoden præsenteret her kan evaluere effekten af reagenser på angiogenese eller vaskulær permeabilitet in vivo uden farvning. Metoden bruger dextran-FITC-injektion via halevenen til at visualisere neo-kar eller vaskulær lækage.
Abstract
Flere modeller er blevet udviklet til at undersøge angiogenese in vivo. Imidlertid er de fleste af disse modeller komplekse og dyre, kræver specialudstyr eller er svære at udføre til efterfølgende kvantitativ analyse. Her præsenterer vi et modificeret matrixgelpropassay for at evaluere angiogenese in vivo. I denne protokol blev vaskulære celler blandet med matrixgel i nærvær eller fravær af proangiogene eller antiangiogene reagenser og derefter subkutant injiceret i ryggen af modtagermus. Efter 7 dage injiceres fosfatbuffersaltvand indeholdende dextran-FITC via halevenen og cirkuleres i beholdere i 30 minutter. Matrixgelpropper opsamles og indlejres med vævsindlejringsgel, derefter skæres 12 μm sektioner til fluorescensdetektion uden farvning. I dette assay kan dextran-FITC med høj molekylvægt (~ 150.000 Da) bruges til at indikere funktionelle beholdere til påvisning af deres længde, mens dextran-FITC med lav molekylvægt (~ 4.400 Da) kan bruges til at indikere permeabiliteten af neo-kar. Afslutningsvis kan denne protokol tilvejebringe en pålidelig og bekvem metode til kvantitativ undersøgelse af angiogenese in vivo.
Introduction
Angiogenese, processen med dannelse af neo-kar fra allerede eksisterende kar, spiller en kritisk rolle i mange fysiologiske og patologiske processer, såsom embryonal udvikling, sårheling, aterosklerose, tumorudvikling osv.1,2,3,4,5. Denne dynamiske proces involverer flere trin, herunder nedbrydning af matrixen, vaskulær celleproliferation, migration og selvorganisering til dannelse af rørformede strukturer og stabilisering af neo-karrene6. Fremme af angiogenese har vist sig at være kritisk i behandlingen af myokardieinfarkt, slagtilfælde og andre former for iskæmiske sygdomme7, mens hæmning af angiogenese er blevet betragtet som en lovende strategi i behandlingen af kræft8 og reumatoid sygdom9. Angiogenese er blevet betragtet som et organiserende princip for lægemiddelopdagelse10. Således er konstruktionen af en pålidelig og bekvem metode til vurdering af omfanget af angiogenese kritisk for mekanisk forskning eller lægemiddelopdagelse i angiogeneseafhængige sygdomme.
Flere in vitro og in vivo modeller er blevet udviklet til evaluering af angiogenese11. Blandt disse kan todimensionelle (2-D) modeller, som matrixgelrørdannelsesassay12, ikke danne funktionelle rørformede strukturer. Dyremodellerne, såsom iskæmi i bagbenene model13,14, kan reproducere angiogeneseprocessen, men er komplekse og kræver et laserspeckle blodgennemstrømningsbilleddannelsessystem. 3D-modeller af vaskulær morfogenese, som matrixgelstikassay, giver en simpel platform, der kan efterligne processen med angiogenese in vivo15, men påvisning af angiogenese kræver immunhistokemi eller immunofluorescensfarvning 16,17,18, som er variable og dårligt visualiserede.
Her beskriver vi en protokol for et modificeret matrixgelstikassay, hvor vaskulære celler blev blandet med matrixgel og subkutant injiceret i bagsiden af mus for at danne et stik. I stikket skal vaskulære celler nedbryde matrixen, proliferere, migrere og selvorganisere for endelig at danne funktionelle kar med blodgennemstrømning i det indre miljø. Derefter injiceres fluorescerende mærket dextran via halevenen for at strømme gennem stikket, og etiketten visualiseres for at indikere neo-fartøjer. Indholdet af angiogenese kan kvantitativt evalueres af længden af karrene. Denne metode kan danne funktionelle kar, der ikke kan produceres i 2-D angiogenese modeller12, og behøver ikke kompleks pletproces som i almindelig matrix gel plug assay11. Det kræver heller ikke dyre specifikke instrumenter som laser speckle blodgennemstrømning billeddannelse system i bagben iskæmi model 13,14,19. Denne metode er alsidig, billig, kvantificerbar og nem at udføre og kan bruges til at bestemme lægemidlers pro- eller antiangiogene evne eller anvendes i mekanisk forskning involveret i angiogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer en pålidelig og bekvem metode til kvantitativ evaluering af angiogenese in vivo uden farvning. I denne protokol blev vaskulære celler blandet med matrixgel i nærvær af proangiogene eller antiangiogene reagenser og derefter subkutant injiceret i bagsiden af Nu/Nu-mus for at danne gelprop (figur 1). Efter 7 dages gelpropdannelse blev dextran-FITC injiceret intravenøst og cirkuleret i 30 minutter. Gelproppen blev opsamlet og indlejret med vævsindlejringsgel, og 12…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LY22H020005) og National Natural Science Foundation of China (81873466).
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion – Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
