Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies
Summary
De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.
Abstract
Er zijn verschillende modellen ontwikkeld om angiogenese in vivo te onderzoeken. De meeste van deze modellen zijn echter complex en duur, vereisen gespecialiseerde apparatuur of zijn moeilijk uit te voeren voor latere kwantitatieve analyse. Hier presenteren we een gemodificeerde matrix gelplug-assay om angiogenese in vivo te evalueren. In dit protocol werden vasculaire cellen gemengd met matrixgel in de aan- of afwezigheid van pro-angiogene of anti-angiogene reagentia, en vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van ontvangende muizen. Na 7 dagen wordt fosfaatbufferzoutoplossing met dextran-FITC via de staartader geïnjecteerd en gedurende 30 minuten in vaten gecirculeerd. Matrixgelpluggen worden verzameld en ingebed met weefselinbeddingsgel, waarna secties van 12 μm worden gesneden voor fluorescentiedetectie zonder kleuring. In deze test kan dextran-FITC met een hoog molecuulgewicht (~150.000 Da) worden gebruikt om functionele vaten aan te duiden voor het detecteren van hun lengte, terwijl dextran-FITC met een laag molecuulgewicht (~4.400 Da) kan worden gebruikt om de permeabiliteit van neovaten aan te geven. Concluderend kan dit protocol een betrouwbare en handige methode bieden voor de kwantitatieve studie van angiogenese in vivo.
Introduction
Angiogenese, het proces van vorming van neovaten uit reeds bestaande vaten, speelt een cruciale rol in veel fysiologische en pathologische processen, zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing, atherosclerose, tumorontwikkeling, enz.1,2,3,4,5. Dit dynamische proces omvat verschillende stappen, waaronder de afbraak van de matrix, vasculaire celproliferatie, migratie en zelforganisatie om buisvormige structuren te vormen en de stabilisatie van de neovaten6. Het is aangetoond dat het bevorderen van angiogenese van cruciaal belang is bij de behandeling van myocardinfarct, beroerte en andere soorten ischemische ziekten7, terwijl het remmen van angiogenese wordt beschouwd als een veelbelovende strategie bij de behandeling van kankers8 en reumatoïde aandoeningen9. Angiogenese wordt beschouwd als een organiserend principe voor de ontdekking van geneesmiddelen10. De constructie van een betrouwbare en handige methode om de omvang van angiogenese te beoordelen, is dus van cruciaal belang voor mechanisch onderzoek of het ontdekken van geneesmiddelen bij angiogenese-afhankelijke ziekten.
Er zijn verschillende in vitro en in vivo modellen ontwikkeld om angiogenesete evalueren 11. Hiervan kunnen tweedimensionale (2D) modellen, zoals matrix gelbuisvormingstest12, geen functionele buisvormige structuren vormen. De diermodellen, zoals het ischemiemodel13,14 van de achterpoten, kunnen het angiogeneseproces reproduceren, maar zijn complex en vereisen een laserspikkelbeeldvormingssysteem. 3D-modellen van vasculaire morfogenese, zoals matrixgelplug-assay, bieden een eenvoudig platform dat het proces van angiogenese in vivo15 kan nabootsen, maar de detectie van angiogenese vereist immunohistochemie of immunofluorescentiekleuring 16,17,18, die variabel en slecht gevisualiseerd zijn.
Hier beschrijven we een protocol voor een gemodificeerde matrix gel plug assay waarbij vasculaire cellen werden gemengd met matrix gel en subcutaan geïnjecteerd in de rug van muizen om een plug te vormen. In de plug moeten vasculaire cellen de matrix afbreken, zich vermenigvuldigen, migreren en zichzelf organiseren om uiteindelijk functionele bloedvaten te vormen met bloedstroom in de interne omgeving. Daarna wordt fluorescerend gelabeld dextran geïnjecteerd via de staartader, om door de plug te stromen, en het label wordt gevisualiseerd om neovaten aan te geven. De inhoud van angiogenese kan kwantitatief worden geëvalueerd aan de hand van de lengte van de bloedvaten. Deze methode kan functionele vaten vormen die niet kunnen worden geproduceerd in 2D-angiogenesemodellen12, en vereist geen complex kleuringsproces zoals in gewone matrixgelplugtest11. Het vereist ook geen dure specifieke instrumenten zoals laserspikkelbloedstroombeeldvormingssysteem in ischemiemodel 13,14,19 van de achterpoten. Deze methode is veelzijdig, goedkoop, kwantificeerbaar en gemakkelijk uit te voeren, en kan worden gebruikt om het pro- of anti-angiogene vermogen van geneesmiddelen te bepalen of kan worden gebruikt in mechanisch onderzoek dat betrokken is bij angiogenese.
Protocol
Representative Results
Discussion
We presenteren een betrouwbare en handige methode voor de kwantitatieve evaluatie van angiogenese in vivo zonder kleuring. In dit protocol werden vasculaire cellen gemengd met matrixgel in aanwezigheid van pro-angiogene of anti-angiogene reagentia, en vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van Nu/Nu-muizen om een gelplug te vormen (Figuur 1). Na 7 dagen vorming van gelpluggen werd dextran-FITC intraveneus geïnjecteerd en gedurende 30 minuten gecirculeerd. De gelplug werd verz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (LY22H020005) en de National Natural Science Foundation of China (81873466).
Materials
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion – Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449 (2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821 (2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
