Il metodo qui presentato può valutare l'effetto dei reagenti sull'angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l'iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Diversi modelli sono stati sviluppati per studiare l'angiogenesi in vivo. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli sono complessi e costosi, richiedono attrezzature specializzate o sono difficili da eseguire per la successiva analisi quantitativa. Qui presentiamo un saggio di gel plug a matrice modificata per valutare l'angiogenesi in vivo. In questo protocollo, le cellule vascolari sono state miscelate con gel di matrice in presenza o assenza di reagenti pro-angiogenici o anti-angiogenici, e quindi iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi riceventi. Dopo 7 giorni, la soluzione salina tampone fosfato contenente destrano-FITC viene iniettata attraverso la vena caudale e fatta circolare nei vasi per 30 minuti. I tappi di gel della matrice vengono raccolti e incorporati con gel di inclusione tissutale, quindi vengono tagliate sezioni da 12 μm per la rilevazione della fluorescenza senza colorazione. In questo test, il destrano-FITC ad alto peso molecolare (~150.000 Da) può essere utilizzato per indicare i vasi funzionali per rilevarne la lunghezza, mentre il destrano-FITC a basso peso molecolare (~4.400 Da) può essere utilizzato per indicare la permeabilità dei neo-vasi. In conclusione, questo protocollo può fornire un metodo affidabile e conveniente per lo studio quantitativo dell'angiogenesi in vivo.
Introduzione
L'angiogenesi, il processo di formazione di neovasi da vasi preesistenti, svolge un ruolo fondamentale in molti processi fisiologici e patologici, come lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, l'aterosclerosi, lo sviluppo del tumore, ecc.1,2,3,4,5. Questo processo dinamico coinvolge diverse fasi, tra cui la degradazione della matrice, la proliferazione delle cellule vascolari, la migrazione e l'auto-organizzazione per formare strutture tubulari e la stabilizzazione dei neo-vasi6....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 luglio 2021). Tutti i reagenti e i materiali di consumo sono elencati nell'Indice dei materiali.
1. Preparazione del terreno di coltura
- 10 terreni di coltura M199: sciogliere la polvere di M199 a una concentrazione di 10 volte con 90 mL di acqua deionizzata e aggiungere 10 mL di siero fetale bovino (FBS), quindi passare attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare il terreno a 4 °C per un massimo ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La Figura 1 è il diagramma di flusso che illustra come preparare la miscela di gel della matrice, cellule vascolari, terreno di coltura e reagente. La miscela è stata quindi iniettata per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi Nu/Nu e riscaldata utilizzando un termoforo per accelerarne la coagulazione e formare infine un tappo di gel.
La Figura 2A è il diagramma di flusso per indicare i recipienti con destrano marcato con fl.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Presentiamo un metodo affidabile e conveniente per la valutazione quantitativa dell'angiogenesi in vivo senza colorazione. In questo protocollo, le cellule vascolari sono state miscelate con gel di matrice in presenza di reagenti pro-angiogenici o anti-angiogenici, e quindi iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi Nu/Nu per formare un tappo di gel (Figura 1). Dopo 7 giorni dalla formazione del tappo di gel, il destrano-FITC è stato iniettato per via endovenosa .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (LY22H020005) e dalla National Natural Science Foundation of China (81873466).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini per microscopio ad adesione | CITOTEST | 188105 | |
| Sistema di anestesia | RWD | R640-S1 | |
| Contatore cellulare | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Piatto per colture cellulari | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | ||
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Cassette per inclusione | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Medium per cellule endoteliali | ScienCell | 35809 | |
| Integratori per la crescita endoteliale | ScienCell | 1025 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblasto Fattore di crescita 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Microscopio a fluorescenza | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Pad riscaldante | Boruida | 30-50-30 | |
| Siringa da insulina | BD | 300841 | |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratorio Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning 356234 | Gel | |
| Media 199 polvere | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubi | Axygen | MCT-150-C | |
| Temperatura di taglio ottimale (OCT) Composto | SUKURA | 4583 | Gel per inclusione tissutale |
| Palmitato Acido | KunChuang | KC001 | |
| Penicillina-Streptomicina liquida | Solarbio | P1400 | |
| Tampone fosfato Soluzione salina | Solarbio | P1022 | |
| Strumenti chirurgici | RWD | RWD | |
| Strumento per iniezione della vena della coda | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Soluzione di tripsina-EDTA | Solarbio | T1320 | |
| Temperatura ultra bassa Congelatore | eppendorf | U410 | |
| Fattore di crescita endoteliale vascolare | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
