Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi

Summary

Il metodo qui presentato può valutare l’effetto dei reagenti sull’angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l’iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.

Abstract

Diversi modelli sono stati sviluppati per studiare l’angiogenesi in vivo. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli sono complessi e costosi, richiedono attrezzature specializzate o sono difficili da eseguire per la successiva analisi quantitativa. Qui presentiamo un saggio di gel plug a matrice modificata per valutare l’angiogenesi in vivo. In questo protocollo, le cellule vascolari sono state miscelate con gel di matrice in presenza o assenza di reagenti pro-angiogenici o anti-angiogenici, e quindi iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi riceventi. Dopo 7 giorni, la soluzione salina tampone fosfato contenente destrano-FITC viene iniettata attraverso la vena caudale e fatta circolare nei vasi per 30 minuti. I tappi di gel della matrice vengono raccolti e incorporati con gel di inclusione tissutale, quindi vengono tagliate sezioni da 12 μm per la rilevazione della fluorescenza senza colorazione. In questo test, il destrano-FITC ad alto peso molecolare (~150.000 Da) può essere utilizzato per indicare i vasi funzionali per rilevarne la lunghezza, mentre il destrano-FITC a basso peso molecolare (~4.400 Da) può essere utilizzato per indicare la permeabilità dei neo-vasi. In conclusione, questo protocollo può fornire un metodo affidabile e conveniente per lo studio quantitativo dell’angiogenesi in vivo.

Introduction

L’angiogenesi, il processo di formazione di neovasi da vasi preesistenti, svolge un ruolo fondamentale in molti processi fisiologici e patologici, come lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, l’aterosclerosi, lo sviluppo del tumore, ecc.1,2,3,4,5. Questo processo dinamico coinvolge diverse fasi, tra cui la degradazione della matrice, la proliferazione delle cellule vascolari, la migrazione e l’auto-organizzazione per formare strutture tubulari e la stabilizzazione dei neo-vasi⁶. È stato dimostrato che la promozione dell’angiogenesi è fondamentale nel trattamento dell’infarto del miocardio, dell’ictus e di altri tipi di malattie ischemiche⁷, mentre l’inibizione dell’angiogenesi è stata considerata una strategia promettente nel trattamento dei tumori⁸ e delle malattie reumatoidi⁹. L’angiogenesi è stata considerata un principio organizzativo per la scoperta di farmaci¹⁰. Pertanto, la costruzione di un metodo affidabile e conveniente per valutare l’estensione dell’angiogenesi è fondamentale per la ricerca meccanica o la scoperta di farmaci nelle malattie dipendenti dall’angiogenesi.

Diversi modelli in vitro e in vivo sono stati sviluppati per valutare l’angiogenesi¹¹. Tra questi, i modelli bidimensionali (2-D), come il test di formazione di tubi di gel a matrice¹², non possono formare strutture tubolari funzionali. I modelli animali, come il modello di ischemia^degli arti posteriori ^13,14, possono riprodurre il processo di angiogenesi, ma sono complessi e richiedono un sistema di imaging del flusso sanguigno a speckle laser. I modelli 3D della morfogenesi vascolare, come il saggio del gel plug della matrice, forniscono una piattaforma semplice in grado di imitare il processo di angiogenesi in vivo¹⁵, ma il rilevamento dell’angiogenesi richiede l’immunoistochimica o la colorazione a immunofluorescenza 16,17,18, che sono variabili e scarsamente visualizzate.

Qui, descriviamo un protocollo per un saggio di gel di matrice modificata in cui le cellule vascolari sono state mescolate con gel di matrice e iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi per formare un tappo. Nel tappo, le cellule vascolari devono degradare la matrice, proliferare, migrare e auto-organizzarsi per formare infine vasi funzionali con flusso sanguigno nell’ambiente interno. Successivamente, il destrano marcato con fluorescenza viene iniettato attraverso la vena caudale, per fluire attraverso il tappo, e l’etichetta viene visualizzata per indicare i neo-vasi. Il contenuto dell’angiogenesi può essere valutato quantitativamente in base alla lunghezza dei vasi. Questo metodo è in grado di formare vasi funzionali che non possono essere prodotti nei modelli di angiogenesi 2D¹² e non richiede un complesso processo di colorazione come nel normale saggio del gel plug^{della matrice 11}. Inoltre, non richiede costosi strumenti specifici come il sistema di imaging del flusso sanguigno a speckle laser nel modello di ischemia dell’arto posteriore 13,14,19. Questo metodo è versatile, a basso costo, quantificabile e facile da eseguire e può essere utilizzato per determinare la capacità pro- o anti-angiogenica dei farmaci o essere utilizzato nella ricerca meccanica coinvolta nell’angiogenesi.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) della Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 luglio 2021). Tutti i reagenti e i materiali di consumo sono elencati nell’Indice dei materiali. 1. Preparazione del terreno di coltura 10 terreni di coltura M199: sciogliere la polvere di M199 a una concentrazione di 10 volte con 90 mL di acqua dei…

Representative Results

La Figura 1 è il diagramma di flusso che illustra come preparare la miscela di gel della matrice, cellule vascolari, terreno di coltura e reagente. La miscela è stata quindi iniettata per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi Nu/Nu e riscaldata utilizzando un termoforo per accelerarne la coagulazione e formare infine un tappo di gel. La Figura 2A è il diagramma di flusso per indicare i recipienti con destrano marcato con…

Discussion

Presentiamo un metodo affidabile e conveniente per la valutazione quantitativa dell’angiogenesi in vivo senza colorazione. In questo protocollo, le cellule vascolari sono state miscelate con gel di matrice in presenza di reagenti pro-angiogenici o anti-angiogenici, e quindi iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi Nu/Nu per formare un tappo di gel (Figura 1). Dopo 7 giorni dalla formazione del tappo di gel, il destrano-FITC è stato iniettato per via endovenosa…

Materials

Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105
Anesthesia System	RWD	R640-S1
Cell Counter	Invitrogen	AMQAX1000
Cell Culture Dish	Corning	430167
Cryoslicer	Thermo Fisher	CryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDa	WEIHUA BIO	WH007N07
Dextrans-FITC-4kDa	WEIHUA BIO	WH007N0705
Embedding Cassettes	CITOTEST	80203-0007
Endothelial Cell Medium	ScienCell	35809
Endothelial Growth Supplements	ScienCell	1025
Fetal Bovine Serum	Gibco	10100147C
Fibroblast Growth Factor 1	AtaGenix	9043p-082318-A01	FGF1
Fluorescence Microscope	Nikon	ECLIPSE Ni
Heating Pad	Boruida	30-50-30
Insulin Syringe	BD	300841
Isoflurane	RWD	R510-22-10
Laboratory Balance	Sartorius	BSA124S-CW
Matrigel	Corning	356234	Matrix gel
Medium 199 powder	Gibco	31100-035
Microtubes	Axygen	MCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound	SUKURA	4583	Tissue embedding gel
Palmitate Acid	KunChuang	KC001
Penicillin-Streptomycin Liquid	Solarbio	P1400
Phosphate Buffer Saline	Solarbio	P1022
Surgical Instruments	RWD	RWD
Tail Vein Injection Instrument	KEW BASIS	KW-XXY
Trypsin-EDTA Solution	Solarbio	T1320
Ultra-Low Temperature Freezer	eppendorf	U410
Vascular Endothelial Growth Factor	CHAMOT	CM058-5HP	VEGF